赤紅球菌OA1多環(huán)芳烴降解酶系基因簇結構和功能初探.pdf

1、多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)是一類廣泛分布的有機污染物,其對生態(tài)系統(tǒng)毒性大,自然條件下難降解。如何清除此類污染物是全球最關注的問題之一,并且多種具有降解和轉化PAHs功能的微生物已成為全球研究熱點。在實驗室前期研究中分離得到一株既能高效降解多環(huán)芳烴又能高效降解苯甲酸的赤紅球菌菌株OA1,本實驗對赤紅球菌OA1多環(huán)芳烴降解基因簇的結構和功能等進行了初步研究,為利用該類細菌資源預防

2、、監(jiān)測和控制環(huán)境多環(huán)芳烴污染及生態(tài)恢復提供理論依據(jù)和技術支持。
　　利用赤紅球菌OA1作為實驗菌株,用溶菌酶和酚/氯仿抽提法從菌體中提取高質(zhì)量全基因組DNA,經(jīng)過隨機機械剪切、T4 DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶末端修復,電泳檢測并回收40kb左右的片段,利用Fast-Link? DNA Ligase連接酶使之與CopyControl pCC2FOS載體連接,再經(jīng)MaxPlax? Lambda Packaging Extracts

3、體外包裝形成噬菌體,之后再轉染E.coli EPI300-T1R宿主菌,成功構建了滴度為1x104 CFU/ml的赤紅球菌OA1 Fosmid基因組文庫。
　　以NCBI數(shù)據(jù)庫中已報道PAHs生物降解菌的環(huán)羥化雙加氧酶(ring-hydroxylating dioxygenase, RHD)基因的序列為基礎,利用Primer Premier5.0軟件設計引物,以赤紅球菌OA1的基因組DNA為模板,擴增獲得約為300bp的RHD基因

4、的核心片段。利用DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I試劑盒將PCR獲得的OA1-RHD標記為探針,并以此作為靶基因在構建的基因組文庫中通過菌落原位雜交篩選含有多環(huán)芳烴降解基因簇的陽性克隆,結果獲得兩個陽性克隆子。
　　對獲得的陽性克隆子抽提質(zhì)粒送樣測序,并對獲得的DNA序列進行基因結構分析和功能預測,進而找到多環(huán)芳烴降解過程中游途徑的原兒茶酸降解基因簇,其中

5、3,4-雙加氧酶(P34D)編碼基因在該基因簇中占重要位置。根據(jù)P34D的全基因序列設計特異性引物,經(jīng) PCR擴增后連接到含有 T7啟動子的高效表達載體 pET-30a(+)上,并轉化到宿主菌E. coliBL21( DE3)中,成功篩選出P34D的高效表達重組菌株。通過對重組菌誘導表達條件的優(yōu)化,實現(xiàn)了P34D融合蛋白的高效表達,酶活檢測顯示異源表達的P34D對原兒茶酸有催化降解的作用。實驗結果表明,所發(fā)現(xiàn)的基因簇為原兒茶酸降解基因簇