產(chǎn)酶溶桿菌Lsp蛋白質(zhì)與NRPS-PKS基因簇的功能研究.pdf

1、產(chǎn)酶溶桿菌屬于溶桿菌屬、黃單胞科。菌株OH11是本實(shí)驗(yàn)室自主分離鑒定的一種新型生防細(xì)菌。HSAF是該菌株中報(bào)道的一種結(jié)構(gòu)和作用方式全新的廣譜抗真菌卵菌物質(zhì)。WAP-8294A2也是該菌株中新發(fā)現(xiàn)的一種抗革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的活性物質(zhì)。Ax21蛋白質(zhì)是黃單胞科病原細(xì)菌中新發(fā)現(xiàn)的一種參與致病性的小分子外泌蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)的編碼基因在病原細(xì)菌中只有一個(gè)拷貝。
　　論文第一章內(nèi)容主要以Stenotrophomonas maltophilia(S

2、m)中Ax21Sm(Smlt0387)蛋白質(zhì)作為同源比對(duì)的參考序列，通過(guò)生物信息學(xué)分析，在產(chǎn)酶溶桿菌OH11全基因組中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)Ax21Sm蛋白質(zhì)的同系物，將其命名為L(zhǎng)sp1、Lsp2和Lsp3(Lysobacter Small Protein)。這3個(gè)蛋白質(zhì)在氨基酸水平上與Ax21Sm相比分另別具有44％(Lsp1)、26％(Lsp2)和26％(Lsp3)的同源性。它們彼此之間也具有28％(Lsp1與Lsp2)、43％（Lsp2與Ls

3、p3）和34％（Lsp1與Lsp3）的氨基酸序列同源性。此外，與Ax21Sm相似，這3個(gè)蛋白質(zhì)的N端均具有一段保守的分泌型信號(hào)肽。單獨(dú)缺失這3個(gè)lsp基因，發(fā)現(xiàn)野生型OH11合成抗菌物質(zhì)HSAF和WAP-8294A2的能力顯著下降，表明這3個(gè)lsp基因均參與調(diào)控這兩種抗菌物質(zhì)的生物合成。對(duì)這3個(gè)基因進(jìn)行組合式雙突變以及三突變，共構(gòu)建獲得3個(gè)雙基因缺失突變株和1個(gè)三基因缺失突變株。產(chǎn)量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，參試的雙基因和三基因缺失突變中HSAF和WA

4、P-8294A2的產(chǎn)量均顯著下降，但與單基因缺失突變株不存在明顯差異，揭示這3個(gè)lsp基因在調(diào)控HSAF和WAP-8294A2生物合成方面不存在累積作用。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)lsp3基因可以彌補(bǔ)由lsp1和lsp2基因造成的HSAF產(chǎn)量降低的現(xiàn)象，而其它基因則不具備此功能。
　　此外，這3個(gè)lsp基因單獨(dú)缺失后導(dǎo)致野生型OH11生長(zhǎng)緩慢，但不改變野生型產(chǎn)生三種胞外酶（纖維素酶、蛋白酶和幾丁質(zhì)酶）的能力。
　　本部分首次在黃單胞科生防細(xì)

5、菌——產(chǎn)酶溶桿菌中同時(shí)克隆了3個(gè)Ax21的同系物，并且發(fā)現(xiàn)三者均具有調(diào)控次生代謝產(chǎn)物生物合成的功能。且lsp3基因具有彌補(bǔ)lsp1和lsp2造成的HSAF降低的功能。
　　而在第二章中，聚酮類和非核糖體肽類化合物結(jié)構(gòu)多樣、功能強(qiáng)大，是天然產(chǎn)物的兩類代表，分別由聚酮合成酶(PKS)及非核糖體肽合成酶(NRPS)合成。產(chǎn)酶溶桿菌作為一種新型生防菌的典型代表，對(duì)多種植物病原菌都有防治效果。此外，產(chǎn)酶溶桿菌還產(chǎn)生了一些抗生素，如抗菌類的W

6、AP-8294A2和抗真菌的HSAF。在OH11基因組中又發(fā)現(xiàn)了四個(gè)新的PKS、NRPS和PKS/NRPS雜合基因簇，基因簇命名從A-D。本研究主要從這四個(gè)基因簇中選取五個(gè)PKS或NRPS基因進(jìn)行缺失突變，結(jié)果顯示:一個(gè)PKS(A基因簇)和一個(gè)NRPS基因（D基因簇）可以通過(guò)WAP-8294A2途徑調(diào)控抗菌活性。此外，也證實(shí)了PKS、NRPS基因也參與了菌落形態(tài)的調(diào)控，但五個(gè)突變菌株抗真菌活性均不受影響，也不參與已知抗生素HSAF的生物