高效嗜熱L-海因酶系產(chǎn)生菌篩選及其基因簇序列解析.pdf

1、手性氨基酸，特別是用發(fā)酵法難以生產(chǎn)的天然、非天然或非蛋白氨基酸在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)及手性藥物合成等領(lǐng)域具有廣泛的用途，作為主要制備方法之一的L－海因酶系法制備L－氨基酸技術(shù)受到人們的普遍關(guān)注。本文綜述了海因酶法制備光學(xué)純氨基酸的原理及應(yīng)用，在海因酶多樣性及構(gòu)效關(guān)系的基礎(chǔ)上，針對(duì)海因底物溶解度低、海因酶系相關(guān)酶熱穩(wěn)定性較差，較大程度地限制了海因酶法制備光學(xué)純氨基酸技術(shù)的應(yīng)用等問(wèn)題，重點(diǎn)篩選了耐熱海因酶和氨甲酰水解酶產(chǎn)生菌，研究了海因酶產(chǎn)生菌

2、分布特點(diǎn)及最佳候選菌株MH602的發(fā)酵條件、產(chǎn)酶條件、酶底物特異性等，克隆了MH602海因酶系基因簇序列，解析了基因簇序列相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)特征，進(jìn)一步分析了海因酶和氨甲酰水解酶的進(jìn)化地位。本文的主要研究成果如下：
　　 (1)以DL-5－取代海因?yàn)槲ㄒ坏?、建立了PDAB顯色法與酚紅平板顯色法相結(jié)合的快速檢測(cè)手段，從土壤樣品中篩選到有較好雙酶海因酶和氨甲酰水解酶產(chǎn)生菌24株。這些菌株最適生長(zhǎng)溫度為45－55℃。24株菌轉(zhuǎn)化DL-5

3、－芐基海因的產(chǎn)物氨基酸構(gòu)型分析表明：其中17株菌生成L－氨基酸，7株生成D－氨基酸，這與文獻(xiàn)報(bào)道的70％以上菌株是D－海因酶系產(chǎn)生菌不同。推測(cè)L－海因酶系產(chǎn)生菌的分布可能與嗜熱菌有關(guān)。經(jīng)Biolog菌種鑒定和16S rDNA序列分析鑒定結(jié)果表明，海因酶與氨甲酰水解酶產(chǎn)生菌主要分布在Bacillus，Geobacillus，Brevibacillus，Aneurinibacillus，Microbacterium，Kurthia等菌屬中，

4、海因酶系產(chǎn)生菌在不同菌屬中的分布具有廣泛性。
　　 (2)利用16S rDNA序列對(duì)海因酶產(chǎn)生菌的系統(tǒng)發(fā)育分析表明：大多數(shù)L-海因酶系產(chǎn)生菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，主要屬于芽胞桿菌屬Bacillus、Aneurinibacillus、Brevibacillu、Kurthia、Geobacillus和非芽胞桿菌屬M(fèi)icrobacterium、Arthrobacter等。這組菌耐熱性好，最適生長(zhǎng)溫度45-55℃。而大多數(shù)D-海因酶產(chǎn)生菌是革

5、蘭氏陰性菌，主要分布于Pseudomonas，Agrobacterium和Burkholderia等菌屬中，這類(lèi)細(xì)菌的生長(zhǎng)溫度在30℃左右。海因酶與氨甲酰水解酶產(chǎn)生菌轉(zhuǎn)化DL-5-取代海因生成氨基酸構(gòu)型與種屬分布、菌株生長(zhǎng)溫度緊密相關(guān)。
　　 (3)優(yōu)化了最佳候選菌Bacillus fordii MH602的發(fā)酵與產(chǎn)酶條件，研究了酶的相關(guān)性質(zhì)。最適培養(yǎng)基組分為(g L-1)：甲基海因1.6、蔗糖10、氯化鈉3、磷酸二氫鉀9、硫酸

6、鎂0.25、玉米漿15 mL L-1，pH7.5。誘導(dǎo)劑甲基海因的最適加入時(shí)間是菌體發(fā)酵到8 h。該菌海因酶是胞內(nèi)酶，海因酶和氨甲酰水解酶的最適反應(yīng)溫度分別為60℃和45℃，最適pH分別為8.0，7.5。MH602粗酶液轉(zhuǎn)化芐基海因?yàn)長(zhǎng)-苯丙氨酸的最高摩爾轉(zhuǎn)化率為88.6％。海因酶和氨甲酰水解酶粗酶液分別在50℃和45℃保持6 h后，殘留活性幾乎無(wú)損失，顯示了較好的熱穩(wěn)定性。雙酶具有較廣泛的底物譜，對(duì)芳香族海因如芐基海因、苯海因具有較高

7、的選擇性，短側(cè)鏈的脂肪族海因如海因，甲基海因次之，長(zhǎng)側(cè)鏈脂肪族海因選擇性較差。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化中間體及產(chǎn)物的構(gòu)型分析表明：海因酶是非選擇性的，而N-氨甲酰水解酶是嚴(yán)格L-選擇性的。
　　 (4)采用基因組步移法擴(kuò)增得到MH602 L-海因酶系新基因簇序列，其全長(zhǎng)8021 bp。經(jīng)Blast檢索分析基因簇發(fā)現(xiàn)5個(gè)閱讀框，依次為：二氫嘧啶脫氫酶、海因酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、超蛋白及L-N-氨甲酰水解酶。二氫嘧啶酶與Bacillus sp.NRRLB

8、-14911的二氫嘧啶酶同源性最高為74％；海因酶與Bacillus sp.KNK245海因酶同源性最高為71％；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與Bacillus sp.B14905同源性最高為60％；超蛋白與Geobacillus kaustophilus HTA426的超蛋白同源性最高為39％；N－氨甲酰水解酶與Bacillus clausii的L-N－氨甲酰水解酶同源性最高為45％。該耐熱性海因酶與氨甲酰水解酶基因均為新基因及相關(guān)酶基因均為新基因，海因

9、酶系基因簇序列排列方式與其它報(bào)道的海因酶基因簇存在較大差異，雖然具有相同的轉(zhuǎn)錄方向，但海因酶和氨甲酰水解酶基因?qū)俜沁B續(xù)分布，被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和超蛋白基因阻隔；且海因酶和L-N－氨甲酰水解酶基因分別有明顯的啟動(dòng)子特征區(qū)域，而已報(bào)道的L－海因酶系基因簇序列往往共用相同的啟動(dòng)子，此發(fā)現(xiàn)可指導(dǎo)MH602雙酶的高效誘導(dǎo)。將海因酶與氨甲酰水解酶分別在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證了該基因的功能。
　　 (5)對(duì)海因酶同源性及其進(jìn)

10、化地位進(jìn)行了分析。不同微生物來(lái)源的D-海因酶、L－海因酶和DL-海因酶基因序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)存在相同的保守區(qū)，如推測(cè)的金屬離子結(jié)合中心PGXXDXHXH及四個(gè)保守的天冬氨酸殘基和一個(gè)賴(lài)氨酸殘基，這些典型的保守區(qū)可能與酶的活性中心有重要關(guān)系。各海因酶C－末端同源性均較低。海因酶進(jìn)化地位分析發(fā)現(xiàn)，MH602海因酶與其它金屬依賴(lài)性的海因酶如二氫嘧啶酶、海因酶、二氫乳氫酸酶、尿囊素酶一樣，屬于脲酶相關(guān)的氨基水解酶超家簇成員之一，這些海因酶催化的底

11、物有相同的結(jié)構(gòu)特征。MH602屬于海因酶亞家簇成員，不同構(gòu)型的海因酶形成一簇，進(jìn)化地位并無(wú)明顯差別。
　　 (6)分析了L-N－氨甲酰水解酶和β－丙氨酸合成酶同源性及其進(jìn)化地位。不同微生物來(lái)源的L-N－氨甲酰水解酶和β-丙氨酸合成酶序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)同源性較低，但存在相同的保守序列。MH602的L-N－氨甲酰水解酶與Sinorhizobium meliloti，Pseudomonas sp BS的L-N－氨甲酰水解酶同源性最高，分別

12、為45％和44％，與Saccharomyces Muyveri的β-丙氨酸合成酶同源性為32％。L-N－氨甲酰水解酶與D-N－氨甲酰水解酶的同源性?xún)H為10％左右。對(duì)N－氨甲?；騈－乙酰氨基水解酶的氨基酸序列的進(jìn)化地位分析表明：MH602 N－氨甲酰水解酶是D-N－氨甲酰水解酶、L-N－乙酰氨基水解酶、D-N－乙酰氨基水解酶和β-丙氨酸合成酶形成的超家族成員之一。MH602 N－氨甲酰水解酶屬于L-N－氨甲酰水解酶和β-丙氨酸合成酶亞家族