紅球菌P14中參與多環(huán)芳烴降解的新型雙加氧酶功能分析.pdf

1、多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是由兩個(gè)或兩個(gè)以上的苯環(huán)聚合而成的一類化合物,由于具有高的熱穩(wěn)定性和疏水性極極難降解,且具有強(qiáng)的生物毒性,對(duì)人類和環(huán)境造成非常強(qiáng)的毒害作用。根據(jù)報(bào)道,環(huán)羥化雙加氧酶(RHD)為降解多環(huán)芳烴的限速酶。本實(shí)驗(yàn)室前期篩選到一株紅球菌P14,不僅具有油類浮起的特性,還可以高效降解苯并芘、芘和菲等多環(huán)芳烴。通過全基因組測(cè)序,發(fā)現(xiàn)基因組中存在大量參與多環(huán)芳烴降解的

2、基因簇。
　　本文在紅球菌P14降解特性和全基因組測(cè)序基礎(chǔ)上,從基因組中篩選到的預(yù)測(cè)的RHDs,分析其在三種底物苯并芘、芘和菲誘導(dǎo)下的轉(zhuǎn)錄水平;并對(duì)在苯并芘和芘表達(dá)上調(diào)的兩組酶進(jìn)行了系統(tǒng)分類,為之找到了與之同源的電子傳遞鏈;以及RHD與之同源的電子傳遞鏈的共表達(dá)以及重組菌株對(duì)多種多環(huán)芳烴的降解率分析,初步闡述了多環(huán)芳烴的代謝路徑途徑。主要的研究結(jié)果如下:
　　(1)通過全基因組測(cè)序,篩選到10組預(yù)測(cè)的環(huán)羥化雙加氧酶。選用了三

3、種底物苯并芘、芘和菲,對(duì)10組預(yù)測(cè)的環(huán)羥化雙加氧酶的在三種底物誘導(dǎo)下的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了RT-PCR分析。基因RHD(bidA和bidA2)在苯并芘和芘誘導(dǎo)下特異性表達(dá)或表達(dá)上調(diào),推測(cè)基因bidAB和bidA2B2可能參與多環(huán)芳烴的苯并芘和芘的降解。根據(jù)bidA和bidA2與相關(guān)蛋白質(zhì)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹,基因bidA與紅串紅球菌TA421中末端雙加氧酶大亞基有中等程度的氨基酸相似度為69％;bidA2與來不動(dòng)桿菌ADP1環(huán)羥雙加氧酶大亞基an

4、tA有較低的氨基酸相似度(49.6%)。
　　(2)通過對(duì)環(huán)羥化雙加氧酶進(jìn)行系統(tǒng)分類,bidA為TypeIVRHO,bidA2為TypeIIRHO。在基因bidAB的上下游找到與之同源的電子傳遞鏈[2Fe-2S]-type鐵氧化還原蛋白bidC和GR-type鐵氧化還原蛋白還原酶(bidD),在bidA2B2的上下游找到了與之同源的電子傳遞鏈FNRN-type鐵氧化還原蛋白還原酶bidC2。
　　(3)為了研究RHD(bid

5、ABCD和bidA2B2C2)在多環(huán)芳烴降解中的作用,將其分別構(gòu)建共表達(dá)載體(pACYCDuet-1和pETDuet-1)轉(zhuǎn)入大腸桿菌中,構(gòu)建了兩株重組菌。重組菌bidABCD對(duì)萘的降解率最高達(dá)84%,對(duì)苯并芘和蒽也有較高效的降解,降解率分別為54%和48.5%,對(duì)苯并蒽和芘有較低的降解率分別為37%和19.29%,而初步實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)菲、芴和1,1-聯(lián)苯?jīng)]有明顯的降解。與重組菌bidABCD不同的是,bidA2B2C2對(duì)多環(huán)芳烴萘和蒽都有