一株可裂解大腸桿菌和沙門氏菌的噬菌體基因組學分析及其裂解酶活性鑒定.pdf

1、大腸桿菌和沙門氏菌是兩種重要的人畜共患病的病原，在世界范圍內已經(jīng)造成了重大的經(jīng)濟損失并嚴重威脅著公共衛(wèi)生安全。隨著抗生素的大量和不合理使用，這兩種細菌的多重耐藥菌株層出不窮，使得新型有效抗菌制劑的開發(fā)迫在眉睫。由于噬菌體及其裂解酶與細菌長期共同進化，且具有高效殺菌活性，因此這兩者作為新的抗生素替代物或者是對抗生素的一種補充得到科學界的重視。本研究旨在分離鑒定針對大腸桿菌和沙門氏菌的多價噬菌體，并獲取其裂解酶，試圖開發(fā)針對這兩種致病菌的新

2、型抗菌制劑。
　　本研究以一株臨床分離的豬源大腸桿菌為宿主菌，從污水中分離純化到一株烈性噬菌體，命名為 ECGD1。用磷鎢酸負染法觀察其形態(tài)，并進一步測定其最佳感染復數(shù)及宿主譜。對ECGD1進行全基因序列測定，利用生物信息學軟件進行基因預測和功能注釋，并通過全基因組序列比對分析ECGD1與相關噬菌體的進化關系。通過基因組學分析，預測ECGD1裂解酶基因，利用基因工程手段進行體外表達，并進一步鑒定表達產(chǎn)物的裂解活性及與多粘菌素B的協(xié)

3、同抑菌效果。
　　結果顯示：
　?。?）大腸桿菌噬菌體ECGD1可形成透明、邊緣清晰的噬菌斑；電鏡下觀察到ECGD1具有典型的二十面體頭部和伸縮性的尾部，尾部附有一簇尾絲，屬于有尾噬菌體目，肌尾噬菌體科；最佳感染復數(shù)為10-3；通過宿主譜測定，發(fā)現(xiàn)ECGD1是一株寬裂解譜噬菌體，可裂解臨床分離的6株大腸桿菌（6/12）和17株沙門氏菌（17/26），同時還可裂解大腸桿菌基因工程菌株DH5α和BL21。
　?。?）通過基

4、因組測序及分析，發(fā)現(xiàn)ECGD1基因組全長146647 bp，平均GC含量為37.5％，包含11個tRNA和2個pseudo-tRNA基因；共預測出234個CDS，78個被賦予假定的功能，另外156個功能未知。已賦予功能的CDS，可分為核苷酸代謝/DNA復制/重組、基因組包裝、結構蛋白基因、裂解基因和其它功能基因等五大類；全基因組比對發(fā)現(xiàn)，ECGD1與大腸桿菌噬菌體phi92同源性很高，屬于rv-5 like屬的成員。
　　（3）本

5、試驗成功構建了表達裂解酶的重組質粒 pET-32a-lysin，在BL21（DE3）中成功表達出了裂解酶重組蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分析該表達產(chǎn)物主要為可溶性蛋白，且表達量較高；經(jīng)過活性鑒定，發(fā)現(xiàn)該重組蛋白具有菌內及菌外裂解活性；且該重組蛋白與多粘菌素B的聯(lián)用降低了多粘菌素B的最低抑菌濃度。
　　綜上所述，本研究分離的ECGD1是肌尾噬菌體科rv-5 like屬的成員，是一株寬裂解譜的噬菌體，且經(jīng)體外表達的裂解酶初步鑒定具有殺菌效