腐敗希瓦氏菌噬菌體Spp001基因序列及其裂解活性研究.pdf

1、腐敗希瓦氏菌被認(rèn)定為冷藏鮮魚的特定優(yōu)勢(shì)腐敗菌,是導(dǎo)致魚制品的腐敗重要因素,因此通過控制腐敗希瓦氏菌生長可以延長魚類食品貨架期。內(nèi)溶素是噬菌體繁殖后期釋放子代過程中編碼的一類蛋白,能夠水解宿主菌細(xì)胞壁。內(nèi)溶素因其高效裂解宿主菌和專一性作用宿主菌已經(jīng)應(yīng)用到各個(gè)領(lǐng)域中,包括食品保藏。目前傳統(tǒng)的保鮮方法中還沒有既能專門作用特定腐敗菌又能保持產(chǎn)品品質(zhì)的方法。內(nèi)溶素有望作為新型生物保鮮劑用于防止細(xì)菌感染和控制細(xì)菌的生長。
　　前期工作已經(jīng)證明

2、,噬菌體Spp001用于冷藏牙鲆魚肉的防腐中可以有效延長魚類貨架期并表現(xiàn)出其應(yīng)用潛力。為了更深入的認(rèn)識(shí)與噬菌體Spp001裂解性能,本研究在基因水平上,通過對(duì)噬菌體Spp001全序列分析,尋找與裂解有關(guān)的蛋白,推測(cè)其裂解機(jī)制,并且建立了共沉法提取含有內(nèi)溶素的粗酶液的方法及相應(yīng)的檢測(cè)方法,分析并驗(yàn)證其裂解活性,測(cè)定其酶學(xué)性質(zhì)。
　　本文首次報(bào)道了一株新型腐敗希瓦氏菌噬菌體Spp001全序列基因信息,噬菌體Spp001的宿主菌為腐敗希

3、瓦氏菌Sp225。噬菌體Spp001的基因是雙鏈DNA分子,由54,789-bp組成,一共含有67個(gè)開放閱讀框,G+C的平均含量為49.42％。通過生物信息學(xué)方法分析,對(duì)噬菌體Spp001全序列基因進(jìn)行功能注釋。對(duì)噬菌體有關(guān)裂解基因著重分析,沒有找到明確編碼穴蛋白的基因,最可能編碼內(nèi)溶素的基因?yàn)镺RF62。綜合分析結(jié)果Spp001裂解機(jī)制可能是依靠內(nèi)溶素單獨(dú)起作用,而不是和孔蛋白共同起作用。
　　為了確定噬菌體 Spp001的裂解

4、活性,通過共沉法提取噬菌體 Spp001裂解液,并利用濁度法和擴(kuò)散法分析裂解液的活性。結(jié)果表明裂解液中含有內(nèi)溶素,可使OD590在15 min內(nèi)下降0.160,其底物菌體并未經(jīng)過任何處理。橫向比較裂解液、噬菌體、溶菌酶與死菌、活菌、細(xì)胞壁肽聚糖作用15 min的裂解效果,結(jié)果表明噬菌體Spp001裂解液裂解細(xì)胞壁的活性較好,并且能在較短的時(shí)間(5 min)內(nèi)發(fā)揮作用。通過測(cè)定堿性磷酸酶(AKP)含量變化和分析透射電鏡圖片,得出裂解液可導(dǎo)

5、致菌體細(xì)胞壁甚至細(xì)胞膜破裂。
　　本研究后期分析噬菌體Spp001裂解液反應(yīng)最適條件,結(jié)果表明:裂解液在pH6-8的范圍具有較高的酶活力,最適pH為7。在20-30°C下,有較高的酶活力,最適反應(yīng)溫度為30°C。對(duì)濁度法測(cè)定酶活條件優(yōu)化后,可使酶活從160 U/mL提高到380 U/mL。同時(shí)得出裂解液不需要金屬離子保持活力并且有一定的耐鹽性和耐熱,50°C溫育24 h仍可以測(cè)到酶活。另外利用外膜通透劑(0.1%Triton-X-