摩氏摩根菌噬菌體MmP1生物學(xué)特性及其基因組學(xué)的研究.pdf

1、摩氏摩根菌(亦稱摩根摩根菌)歸屬腸桿菌科摩根菌屬,僅有1個種,革蘭染色陰性,其形態(tài)與變形桿菌相似。該菌廣泛分布于自然界,人和動物糞便中,是引起醫(yī)院感染重要病原菌之一,且當(dāng)今發(fā)生感染的頻率較過往有所增加。噬菌體作為細(xì)菌的病毒,是微生物中的非細(xì)胞形態(tài)的低級生命形式,它在自然界中廣泛存在,是生物圈中數(shù)量最多的生命形式。有人估計,自然界中噬菌體的數(shù)量達(dá)1031之巨。而現(xiàn)實中人們對它的了解仍然很少,截止2008年4月底,目前已完成測序并登錄Gen

2、Bank的噬菌體基因組才484個,噬菌體的研究仍然需要更多積累。因噬菌體基因組較小,現(xiàn)有更多的噬菌體在被測序研究中,但是并沒有一株摩氏摩根菌噬菌體。
　　 噬菌體是細(xì)菌之間基因水平轉(zhuǎn)移的重要載體,是除質(zhì)粒之外的一股重要基因流,在細(xì)菌基因組的進(jìn)化,細(xì)菌的致病性和耐藥性中具有非常關(guān)鍵的作用。近年的研究表明,多價噬菌體和經(jīng)人工改造形成的“廣宿主譜”噬菌體在細(xì)菌感染性疾病的治療上有著巨大的前景,對噬菌體展開廣泛和深入的研究具有重要的基礎(chǔ)

3、意義和潛在的臨床價值。摩氏摩根菌作為醫(yī)院感染重要病原菌,臨床耐藥問題比較嚴(yán)重,研究其噬菌體并潛在地作為“治療用藥”就具有重要的意義。
　　 本文以摩氏摩根菌的一株臨床分離株作為宿主菌,從附屬醫(yī)院下水道污水中分離到1株噬菌體,命名為MmP1。首先對其生物學(xué)特性進(jìn)行了重點研究;其次提取基因組送北京華大基因研究中心進(jìn)行測序,并通過實驗將“環(huán)狀”的基因組鑒定為線性;進(jìn)而,分離結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行N-端測序并確定其編碼基因;最后對基因組進(jìn)行了初步

4、注釋,證實噬菌體MmP1屬于T7噬菌體家族。研究內(nèi)容及結(jié)果主要包括以下幾個方面。
　　 1.確定腸桿菌科細(xì)菌為摩氏摩根菌。腸桿菌科細(xì)菌由本校附屬西南醫(yī)院檢驗科自臨床標(biāo)本中分離得到,檢驗儀器只鑒定為腸桿菌科,未能進(jìn)一步細(xì)化。在實驗中,我們設(shè)計了一對擴(kuò)增腸桿菌科細(xì)菌的16s rDNA保守引物,通過PCR擴(kuò)增出一段序列長為1.5kb的條帶,送上海英駿公司測序。測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站經(jīng)BLAST比對,發(fā)現(xiàn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與多株摩氏摩根菌的

5、16s rRNA序列100％相同,從而確定本株腸桿菌為摩氏摩根菌。
　　 2.以摩氏摩根菌為宿主菌,從西南醫(yī)院下水道污水中分離到1株具有半透明噬斑的溶原性噬菌體MmP1。噬菌體DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindⅢ酶切鑒定為dsDNA。其噬菌體滴度為2×1011,電鏡觀察發(fā)現(xiàn)有一個多面體立體對稱的頭部,直徑約55nm,并有一個很短的尾巴,形態(tài)學(xué)上屬于短尾噬菌體科。SDS-PAGE蛋白電泳分析發(fā)現(xiàn),在中分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi),凝膠上至少出

6、現(xiàn)了7條蛋白條帶,表明噬菌體MmP1中至少含有7個結(jié)構(gòu)蛋白。噬菌體MmP1感染其宿主菌摩氏摩根菌的最佳感染復(fù)數(shù)是0.1。根據(jù)一步生長曲線可知,噬菌體MmP1感染宿主菌的潛伏期約為10min,爆發(fā)期約為40min,爆發(fā)量約為105。
　　 3.將噬菌體MmP1基因組DNA提取純化后送北京華大基因研究中心進(jìn)行全基因組測序。經(jīng)BLAST比對檢索,確定噬菌體MmP1為一全新噬菌體,是第一個被測序的摩氏摩根菌噬菌體。同時用PCR擴(kuò)增的方法

7、,鑒定了其木端序列的正確性。利用基因組的物理圖譜和電子酶切圖譜的比較,將測序的“環(huán)狀”基因組鑒定為線性,同時推測它可能有5’-突出粘性末端序列存在。
　　 4.噬菌體MmP1基因組的一般概況。①基因組測序表明該基因組全長為38,233bp,其堿基組成是:A=27.98％,G=25.30％,C=21.24％,T=25.48％,G+C=46.54％,其G+C含量略低于T7噬菌體家族成員T7、phiA1122。②GC島的分析表明噬菌體

8、MmP1基因組上發(fā)現(xiàn)了20個大于200bp的GC島。其中G+C含量偏離最大的兩個基因,即基因35和基因42很可能是水平轉(zhuǎn)移而來的外源基因。③基因表達(dá)全部位于正鏈上,且與噬菌體T7、T3類似,基因結(jié)構(gòu)排列聚集成堆,分早中晚三個時期。
　　 5.基因組的生物信息學(xué)分析以及基因功能的探討。在噬菌體MmP1基因組中具有152個大于100bp的ORFs,其中49個推定為編碼基因,編碼序列總長度為34,359bp,基因的平均DNA長度為70

9、1bp。在整個基因組DNA中,平均每1000bp長度中有1.28個推定基因,基因組中堿基的使用率達(dá)到89.88％。在核苷酸水平,12個推定基因與目前已知的序列有同源性;在氨基酸水平,在公共數(shù)據(jù)庫中共找到28個推定基因編碼產(chǎn)物的同源蛋白質(zhì)。綜合分析,初步確定35個ORFs具有與噬菌體T7、phiA1122相似的功能。進(jìn)而,利用CLUSTALX軟件工具對搜索到的具有顯著相似性的基因進(jìn)行多重比對,通過phylip軟件繪制系統(tǒng)發(fā)生樹,用Tree

10、View軟件觀察結(jié)果,分析其進(jìn)化關(guān)系證實噬菌體MmP1屬于T7噬菌體家族。
　　 6.噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白及其編碼基因的確定。本研究結(jié)果顯示,噬菌體顆粒至少含有7個結(jié)構(gòu)蛋白,其中,38kD蛋白是噬菌體的主要衣殼蛋白。將電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜上進(jìn)行N-端氨基酸測序。將N-端測序得到的氨基酸殘基序列與所有推定基因編碼產(chǎn)物的N-端氨基酸序列相比對,結(jié)合分子量大小,確定了ORF35是其編碼基因。同時,根據(jù)噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白大小的唯一性,

11、確定了69kD蛋白質(zhì)是由ORF48編碼的,150kD蛋白質(zhì)是由ORF42編碼的。
　　 7.基因組的非編碼序列分析表明在基因組上存在著37個長短不一的基因間區(qū)(1-1321bp),同時存在10個基因重疊區(qū),16個基因的編碼框相互之間發(fā)生了重疊。在基因組的5'-、3'-末端分別存在140和204bp的非編碼序列?；蚪M中還存在大量反向重復(fù)序列、正向重復(fù)序列以及1個最長為61bp的串聯(lián)重復(fù)序列。這些重復(fù)序列可能與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA重組

12、以及基因組進(jìn)化有關(guān)。在非編碼序列還發(fā)現(xiàn)了5個可能的轉(zhuǎn)錄終止子,同時找到了5個可能的啟動子。
　　 噬菌體MmP1的全基因組序列已經(jīng)在GenBank登錄(No.EU652770)。
　　 綜上所述,通過本研究,明確了世界上第一株摩氏摩根菌噬菌體MmP1的基本生物學(xué)特性及其基因組組成序列,并對該基因組進(jìn)行了初步注釋。注釋結(jié)果表明MmP1屬于T7噬菌體家族成員,擴(kuò)展了T7噬菌體家族宿主菌的范圍(摩氏摩根菌未見報道為T7噬菌體家