基于RNAi的橘小實(shí)蠅雄性不育技術(shù)研究.pdf

1、橘小實(shí)蠅，Bactrocera dorsalis(Hendel)，作為一種東南亞普遍存在的毀滅性害蟲，能危害超過250種水果蔬菜，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。相對(duì)于化學(xué)農(nóng)藥防治，雄性不育技術(shù)(Sterile insect technique，SIT)防治橘小實(shí)蠅具有特異性高、環(huán)境友好的顯著優(yōu)勢(shì)。傳統(tǒng)的SIT方法通過輻射或化學(xué)不育劑實(shí)現(xiàn)，但由于其降低雄蟲交配能力、生存力、免疫力等生物性能而限制了害蟲防控效果。近期出現(xiàn)的基于遺傳干擾技術(shù)(例如RNA

2、interference(RNAi))的SIT卻展現(xiàn)出巨大的害蟲防治應(yīng)用潛力。RNAi是一種由dsRNA啟動(dòng)的保守基因表達(dá)抑制機(jī)制，已成功應(yīng)用于功能基因組、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)，以及害蟲防控研究領(lǐng)域。雖然RNAi技術(shù)已經(jīng)在眾多農(nóng)業(yè)害蟲中成功實(shí)現(xiàn)，但在田間實(shí)際應(yīng)用之前仍需要克服諸多使用技術(shù)問題。為了開發(fā)基于RNAi的SIT技術(shù)用于防控橘小實(shí)蠅，本研究首先篩選了精子形成關(guān)鍵基因，并驗(yàn)證了其RNAi的雄性不育效果。為了進(jìn)一步提高dsRNA穩(wěn)定性和干擾效

3、果，本研究開發(fā)了關(guān)鍵基因（Boul）的dsRNA的納米顆粒包裝技術(shù)，篩選出最佳的物質(zhì)配比和pH值條件，并驗(yàn)證其對(duì)基于RNAi的雄性不育技術(shù)的改進(jìn)效果。最后，我們應(yīng)用Sf9細(xì)胞系在細(xì)胞水平上研究了最佳制備條件(pH=6.5，Chitosan∶dsRNA=1∶4)下納米材料包裝的dsBoul對(duì)昆蟲細(xì)胞的影響。
　　1.誘導(dǎo)橘小實(shí)蠅雄蟲不育的RNAi靶標(biāo)基因
　　第一部分研究中，我們通過RNA干擾橘小實(shí)蠅雄蟲候選生殖細(xì)胞分化和精子

4、缺失相關(guān)基因，再檢測(cè)其與正常雌蟲交配產(chǎn)卵等繁殖力，研究篩選了誘導(dǎo)雄蟲不育的RNAi靶標(biāo)基因。結(jié)果表明在喂食dsRNA處理后，橘小實(shí)蠅雄蟲中靶基因(Boul,ZPG，dsxM,FZO and Gas8)的表達(dá)水平顯著降低，并嚴(yán)重影響雄性的生殖能力，與對(duì)照組（dsEgfp）相比，卵孵化率降低60％-75％。不同基因dsRNA進(jìn)行不同組合(Boul+ZPG,Boul+dsxM and ZPG+dsxM)干擾試驗(yàn)表明，發(fā)現(xiàn)其RNAi可以進(jìn)一步提

5、升雄性不育效果，其中最佳組合Boul+ZPG可造成86％的雄性不育。最佳的Boul+ZPG dsRNA組合不同使用濃度試驗(yàn)結(jié)果表明250，500，750和1000ng/ul分別造成了20.1％,39.63％,59.24％和86.28％的雄性不育;不同日齡的雄蟲RNAi處理后表明1、5、7、10日齡雄蟲的不育比例分別為86.28％,34.14％,22.60％和10.83％。這些結(jié)果表明在最佳dsRNA組合下進(jìn)行RNAi，可顯著減少雄蟲的精

6、子和活精子的數(shù)量。我們的研究有助于在B.dorsalis中發(fā)展基于RNAi的新型SIT技術(shù)用于防控橘小實(shí)蠅。
　　2.橘小實(shí)蠅dsboul殼聚糖納米顆粒包裝釋放技術(shù)
　　在第二部分研究中，我們進(jìn)一步開發(fā)了dsRNA的納米顆粒包裝釋放技術(shù)。針對(duì)雄性不育效果最好的Boul基因，我們比較了兩種納米顆粒制備方法:1）嵌入法，2)吸收法;同時(shí)比較了三種pH值（6.5，7.5和8.5）條件。qRT-PCR結(jié)果表明，pH的變化可以顯著影響

7、dsBoul的RNAi效率。RNAi處理后持續(xù)25d的觀察結(jié)果表明在pH=6.5條件下嵌入法制備的dsRNA納米顆粒的RNAi效率最高，尤其是在第5天的Boul基因表達(dá)水平僅為對(duì)照組的0.22倍。而吸收法制備的dsBoul納米顆粒處理15，20，25天后的基因表達(dá)水平與嵌入法制備的無顯著差異。在此之后，我們分別使用嵌入法和吸收法，在pH6.5條件下使用了不同質(zhì)量比(1∶1，1∶2，1∶3，1∶4)的殼聚糖:dsRNA組合進(jìn)行納米顆粒制備

8、用于RNAi喂食處理。嵌入法制備條件下，質(zhì)量比為1∶4的殼聚糖:dsRNA組合制備納米顆粒處理25天后基因表達(dá)水平顯著低于處理組（0.6倍），而吸收法制備條件下，不同殼聚糖:dsRNA組合制備的納米顆粒處理后皆與對(duì)照組無顯著性差異。在最適pH6.5條件下，我們進(jìn)一步比較了物質(zhì)配比(Chitosan∶dsRNA)為1∶1，1∶2,1∶3，1∶4條件下的效果，發(fā)現(xiàn)在兩種包裝技術(shù)條件下，1∶4物質(zhì)配比的效果皆優(yōu)于其它配比條件，且嵌入法效果優(yōu)于

9、吸收法。兩種包裝技術(shù)方法對(duì)chitosan納米顆粒尺寸的影響研究結(jié)果表明:嵌入法產(chǎn)生的納米顆粒尺寸約為80nm，優(yōu)于吸收法（約為110nm）。因此在pH6.5和1∶4物質(zhì)配比條件下嵌入法被進(jìn)一步用于后面一系列生物測(cè)定并驗(yàn)證SIT相關(guān)基因的功能。與對(duì)照組(Chitosan/dsEgfp)和無納米材料包裝的dsBoul相比，處理組導(dǎo)致卵孵化減少77％以上，而產(chǎn)卵量差異不顯著。在處理14天后進(jìn)行雄性橘小實(shí)蠅精囊中精子總數(shù)的定量，發(fā)現(xiàn)進(jìn)行Chi

10、tosan/dsBoul處理的雄性橘小實(shí)蠅的精子平均數(shù)目顯著減少;而精子活力測(cè)定則顯示處理組的活精子百分比僅為約20％，顯著低于對(duì)照水平。這些結(jié)果表明納米材料處理顯著提高了dsRNA的穩(wěn)定性和RNAi效率。
　　3.納米材料包裝的dsBoul對(duì)昆蟲細(xì)胞的影響
　　最后，我們檢測(cè)了嵌入法制備的dsBoul納米顆粒材料(Chitosan∶dsRNA=1∶4)對(duì)sf9細(xì)胞系的影響。通過流式細(xì)胞分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)Chitosan/dsBo