SWI-SNF復(fù)合物亞基調(diào)控細(xì)胞衰老及其相關(guān)機(jī)理研究.pdf

1、克服衰老一直是人類的最大夢想之一。機(jī)體衰老除了各器官組織結(jié)構(gòu)和功能衰退，適應(yīng)性和抵抗力降低以外，還會引發(fā)各種衰老相關(guān)的疾病，如糖尿病、帕金森癥、阿爾茨默海氏癥以及各種癌癥等。目前對于衰老方面的通路研究，還有許多不明確的地方。SWI/SNF復(fù)合物是一類染色質(zhì)重塑復(fù)合物家族蛋白，它由多個亞基構(gòu)成，依賴ATP水解釋放的能量來改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制下游因子的表達(dá)。人類的SWI/SNF蛋白質(zhì)家族在細(xì)胞周期的過程中發(fā)揮基礎(chǔ)性的作用，如D

2、NA復(fù)制，生長，分化，延伸，剪接以及DNA損傷的修復(fù)。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，SWI/SNF復(fù)合物亞基，主要是催化亞基BRG1還參與調(diào)控細(xì)胞衰老過程，但對于其他亞基在衰老調(diào)控中的作用和相關(guān)機(jī)制還幾乎沒有具體研究。在本文中，我們采用濃度為150μM的過氧化氫處理人表皮永生化細(xì)胞HaCaT和人黑色素瘤細(xì)胞GLL19,處理時(shí)間為1小時(shí)，構(gòu)建衰老模型，并在此模型基礎(chǔ)上篩選衰老處理前后差異表達(dá)的SWI/SNF復(fù)合物亞基。然后分別在兩種細(xì)胞中過表達(dá)和沉默

3、篩選出的三個亞基，通過SA-β-gal染色、細(xì)胞增殖測定、細(xì)胞周期測定及衰老相關(guān)因子表達(dá)檢測來探究SWI/SNF復(fù)合物亞基參與細(xì)胞衰老調(diào)控和可能的機(jī)制。為衰老相關(guān)通路研究及相關(guān)的臨床治療應(yīng)用打下基礎(chǔ)。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　?、儆脻舛葹?50μM的H2O2處理細(xì)胞1小時(shí)，然后繼續(xù)培養(yǎng)4天，然后用形態(tài)學(xué)觀察、SA-β-gal染色、MTT測定增殖和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期來確認(rèn)衰老表型。結(jié)果顯示，H2O2處理4天后，細(xì)胞形態(tài)變得大而扁平，

4、邊界模糊，呈衰老樣形態(tài)，SA-β-gal染色大部分呈陽性，細(xì)胞增殖明顯受到抑制，細(xì)胞發(fā)生顯著的G2期細(xì)胞周期阻滯。
　?、谟冒攵縍T-PCR的方法來篩選H2O2處理前后差異表達(dá)的SWI/SNF復(fù)合物亞基，并用Western Blot確認(rèn)篩選出的亞基的在蛋白水平變化。結(jié)果顯示：H2O2處理后，BAF57、BAF60a、SNF5和BRG1四個亞基基因水平表達(dá)上調(diào)，由于已有研究表明BRG1在細(xì)胞衰老中的作用，所以選取BAF57、BAF

5、60a、SNF5進(jìn)行進(jìn)一步研究。Western Blot結(jié)果確認(rèn)BAF57、BAF60a、SNF5在H2O2處理后蛋白水平表達(dá)上調(diào)。
　　③在pcDNA-EGFP上構(gòu)建過表達(dá)重組質(zhì)粒pc-BAF57、pc-BAF60a和pc-SNF5，將重組載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，并用半定量RT-PCR和Western Blot確認(rèn)重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞中并表達(dá)，然后用SA-β-gal染色、MTT測定增殖、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。結(jié)果顯示：重組質(zhì)粒構(gòu)建成功

6、，并且在細(xì)胞中高表達(dá)。轉(zhuǎn)染了pc-BAF57、pc-BAF60a和pc-SNF5的細(xì)胞SA-β-gal未見明顯陽性染色，但是細(xì)胞增殖受到明顯抑制，發(fā)生顯著的S期細(xì)胞周期阻滯。表明BAF57、BAF60a、SNF5單獨(dú)過表達(dá)并不能觸發(fā)細(xì)胞衰老，但是會引起明顯的細(xì)胞周期停滯。
　?、躶iRNA轉(zhuǎn)染沉默BAF57、BAF60a、SNF5的表達(dá)，再用H2O2處理，通過SA-β-gal染色和細(xì)胞周期測定來檢測預(yù)先沉默三個亞基對H2O2處理誘

7、導(dǎo)衰老的影響。結(jié)果表明：預(yù)先單獨(dú)沉默BAF57、BAF60a、SNF5的表達(dá)后，SA-β-gal染色陽性細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞周期阻滯現(xiàn)象有所緩解。表明沉默三個亞基后，一部分細(xì)胞繞過了衰老途徑。
　?、萦冒攵縍T-PCR對轉(zhuǎn)染pc-BAF57、pc-BAF60a和pc-SNF5后衰老相關(guān)因子進(jìn)行檢測，然后再用Western Blot檢測沉默BAF57、BAF60a、SNF5，再用H2O2處理后細(xì)胞衰老相關(guān)因子的蛋白表達(dá)水平變化。結(jié)果