運(yùn)輸?shù)鞍讖?fù)合物6A亞基(TRAPPC6A)調(diào)控流感病毒復(fù)制機(jī)制研究.pdf

1、A型流感是一種重要的人畜共患病，其中H1、H2和H3亞型流感病毒已經(jīng)獲得在人群中傳播的能力，而H5、H6、H7、H9和H10亞型流感病毒感染人類的事件也偶有發(fā)生，流感病毒對人類的生存和發(fā)展存在重大威脅。流感病毒本身基因組較小，為8節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒，編碼10種必需氨基酸。流感病毒感染宿主過程中，為了完成復(fù)雜的復(fù)制過程需要大量的宿主因子的協(xié)助。在病毒感染過程中，宿主細(xì)胞為了維持自身正常生命進(jìn)程存在許多宿主因子限制病毒的復(fù)制。病毒感染

2、宿主過程一種復(fù)雜的生理生化過程，研究病毒與宿主因子之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)能夠促進(jìn)對病毒感染和致病機(jī)制的理解，同時可為病毒的防控提供新的思路和方法。
　　流感病毒M2蛋白是由病毒第七節(jié)段基因通過可變剪接編碼的一種多功能蛋白，在病毒的生命周期中扮演多重角色。在病毒感染早期，流感病毒進(jìn)入溶酶體中M2蛋白的離子通道活性被激活導(dǎo)致流感病毒內(nèi)部酸化促進(jìn)vRNP與M1蛋白的解離及釋放。抗病毒藥物金剛烷及其衍生物通過抑制M2蛋白離子通道活性達(dá)到抗病毒

3、作用。在病毒組裝和釋放過程中，有些流感病毒的M2能夠維持反式高爾基體內(nèi)的酸堿度，防止高爾基體內(nèi)環(huán)境的酸化，從而使病毒HA蛋白維持正常的空間構(gòu)象。此外，M2蛋白能夠引起機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)并和自噬、凋亡密切相關(guān)。
　　為了進(jìn)一步探尋M2蛋白的功能以及M2蛋白與宿主之間相互作用的網(wǎng)絡(luò)，本實(shí)驗(yàn)以流感病毒M2蛋白全長及M2蛋白的胞漿區(qū)為誘餌，利用酵母雙雜交技術(shù)，篩選A549、HEK293T、U251和THP-1細(xì)胞cDNA混合文庫，鑒定出與M

4、2蛋白相互作用的新的宿主因子TRAPPC6A蛋白。酵母回交驗(yàn)證證明TRAPPC6A蛋白在酵母系統(tǒng)中與全長M2蛋白及M2蛋白的胞漿區(qū)存在相互作用，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)TRAPPC6A蛋白與M2蛋白在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)存在相互作用。激光共聚焦實(shí)驗(yàn)顯示在過表達(dá)時M2蛋白與TRAPPC6A蛋白在細(xì)胞核周邊共定位。通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明M2蛋白第96位氨基酸是M2蛋白與TRAPPC6A蛋白相互作用的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，M2蛋白缺失最后兩個氨基酸后完全

5、喪失與TRAPPC6A蛋白的結(jié)合能力。自然界中M2蛋白第96位氨基酸絕大多數(shù)為亮氨酸，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明M2蛋白96位氨基酸為亮氨酸時與TRAPPC6A蛋白相互作用最強(qiáng)。TRAPPC6A基因存在四種mRNA，其中mRNA1編碼含173個氨基酸的TRAPPC6A蛋白，mRNA2編碼蛋白TRAPPC6A△其氨基酸序列與TRAPPC6A蛋白序列相同但是在蛋白的近N端區(qū)域缺失14個氨基酸，可變剪輯3和4在靠近N端的區(qū)域發(fā)生移碼突變其編碼的蛋白與

6、TRAPPC6A/TRAPPC6A△同源性很低。通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明TRAPPC6A和TRAPPC6A△蛋白均與M2蛋白存在相互作用。通過檢測A549細(xì)胞發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)主要表達(dá)的為TRAPPC6A△蛋白，TRAPPC6A未檢測到。通過RNA干擾實(shí)驗(yàn)證實(shí)TRAPPC6A△蛋白下調(diào)能夠抑制病毒的復(fù)制，TRAPPC6A△蛋白過表達(dá)的A549細(xì)胞系感染實(shí)驗(yàn)表明過表達(dá)TRAPPC6A△蛋白并不影響病毒的復(fù)制。拯救M2蛋白第97位氨基酸缺失病毒W(wǎng)SN

7、 M2del1和M2蛋白第96和97位氨基酸缺失病毒W(wǎng)SN M2del2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染后48h，細(xì)胞上清中WSN M2del2比WSN、WSN M2del1病毒滴度降低。生長曲線表明WSN M2del2病毒比WSN M2del1和WSN復(fù)制能力差。小鼠實(shí)驗(yàn)顯示W(wǎng)SN M2del2病毒對小鼠致病力比WSN M2del1和WSN低。細(xì)胞流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)A549細(xì)胞中TRAPPC6A△表達(dá)量下降后，相同時間點(diǎn)到達(dá)細(xì)胞膜的M2蛋白數(shù)量增多

8、，而過表達(dá)TRAPPC6A△蛋白后，到達(dá)細(xì)胞膜表面M2蛋白數(shù)量則下降。分別用WSN、WSN M2del1和WSN M2del2病毒感染A549細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)WSN與WSN M2del1毒株M2與內(nèi)源性TRAPPC6A△蛋白在囊泡狀結(jié)構(gòu)中存在共定位，而WSN M2del2病毒M2蛋白與TRAPPC6A△蛋白無共定位現(xiàn)象，結(jié)果表明TRAPPC6A△蛋白通過與M2蛋白的相互作用調(diào)節(jié)M2蛋白到細(xì)胞膜的運(yùn)輸，并減緩M2到細(xì)胞膜的運(yùn)輸速度。總之，本研究