eIF4A3對(duì)流感病毒復(fù)制的影響及其作用機(jī)制研究.pdf

1、流感病毒屬于正粘病毒科的單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組分為八個(gè)節(jié)段，其中編碼PA、PB1、PB2和NP蛋白的基因高度保守，且它們與流感病毒vRNA結(jié)合以后形成vRNP，主要負(fù)責(zé)流感病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制。流感病毒與宿主細(xì)胞相互作用構(gòu)成了病毒感染、復(fù)制、致病及免疫的分子基礎(chǔ)。因此，理解宿主因子與流感病毒的相互作用不僅有利于我們深入了解流感病毒生活周期，也有利于開發(fā)新的抗流感藥物。
　　本實(shí)驗(yàn)室在前期的研究中通過串聯(lián)親和純化實(shí)驗(yàn)篩選到與聚合酶復(fù)

2、合物互作的宿主蛋白eIF4A3(Eukaryotic translation initiation factor4A isoform3)。并且本研究證實(shí)該蛋白可以與流感病毒聚合酶亞基PB1相互作用，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)該蛋白能夠顯著促進(jìn)流感病毒的增殖，促進(jìn)流感病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制。探究該蛋白促進(jìn)流感病毒增殖的作用機(jī)制時(shí)我們發(fā)現(xiàn)eIF4A3過表達(dá)時(shí)可以促進(jìn)流感病毒聚合酶活性，而且這種促進(jìn)作用是通過提高聚合酶系統(tǒng)組裝實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)，eIF4A3干擾時(shí)可以顯

3、著抑制流感病毒vRNP核輸出。這不僅拓展了現(xiàn)有的流感病毒與宿主因子相互作用網(wǎng)絡(luò)，也為以后流感的防控提供了新的思路和方向。主要研究結(jié)果如下:
　　1 eIF4A3促進(jìn)流感病毒增殖
　　本實(shí)驗(yàn)室在前期的研究中通過串聯(lián)親和純化實(shí)驗(yàn)篩選到與流感病毒聚合酶復(fù)合物互作的宿主蛋白eIF4A3，通過檢測(cè)eIF4A3干擾之后對(duì)PR8及HM流感病毒mRNA水平的影響，初步確定了eIF4A3干擾之后可以顯著抑制流感病毒復(fù)制。進(jìn)一步通過TCID50

4、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證eIF4A3對(duì)流感病毒增殖的影響，結(jié)果與上面一致，即eIF4A3干擾之后可以顯著抑制流感病毒的增殖。
　　2流感病毒感染過程中，eIF4A3促進(jìn)流感病毒轉(zhuǎn)錄，復(fù)制
　　在A549細(xì)胞上將eIF4A3干擾和過表達(dá)之后感染HM，并于4h，6h，8h收樣，通過熒光定量方法檢測(cè)eIF4A3對(duì)流感病毒mRNA，cRNA和vRNA水平影響，同時(shí)通過Western檢測(cè)該蛋白對(duì)流感病毒蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果證實(shí)該蛋白在干擾之后可以顯著

5、抑制流感病毒復(fù)制，轉(zhuǎn)錄，過表達(dá)時(shí)能夠顯著促進(jìn)流感病毒轉(zhuǎn)錄，復(fù)制。
　　3 eIF4A3可以和流感病毒聚合酶亞基PB1相互作用
　　通過Co-IP實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)eIF4A3能夠與流感病毒聚合酶亞基PB1發(fā)生相互作用，而與其它亞基不存在相互作用，且在感染情況下eIF4A3與內(nèi)源性PB1也存在相互作用;進(jìn)一步通過激光共聚焦顯微鏡ZEISS檢測(cè)PB1與eIF4A3的亞細(xì)胞定位情況，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)蛋白在空間上存在共定位，主要定位于胞核。

6、>　　4 eIF4A3促進(jìn)流感病毒聚合酶活性
　　用293T細(xì)胞檢測(cè)eIF4A3干擾與過表達(dá)時(shí)對(duì)流感病毒聚合酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)該蛋白過表達(dá)可以顯著促進(jìn)流感病毒聚合酶活性，干擾之后可以顯著抑制聚合酶活性。
　　5在聚合酶系統(tǒng)中，eIF4A3可以促進(jìn)流感病毒聚合酶系統(tǒng)組裝
　　探究eIF4A3促進(jìn)流感病毒聚合酶活性的原因，我們首先將eIF4A3過表達(dá)293T細(xì)胞，24小時(shí)后Western檢測(cè)該蛋白對(duì)流感病毒聚合酶各個(gè)亞基及

7、NP蛋白表達(dá)水平的影響，發(fā)現(xiàn)該蛋白對(duì)各個(gè)蛋白表達(dá)均沒有影響，進(jìn)一步通過Co-IP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)eIF4A3對(duì)該聚合酶系統(tǒng)組裝的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，eIF4A3可以顯著促進(jìn)流感病毒聚合酶系統(tǒng)RNP組裝。
　　6 eIF4A3干擾之后抑制流感病毒vRNP的核輸出
　　將eIF4A3干擾之后接毒HM，并于5h之后進(jìn)行固定，透化，染色，利用激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)eIF4A3干擾之后可以顯著抑制NP蛋白的核輸出。
　　7 eIF