TNF-α基因單核苷酸多態(tài)性及血清水平與退變性腰椎側(cè)凸的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：研究探討腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha TNF-α)基因單核苷酸多態(tài)性和血清中TNF-α水平與退變性腰椎側(cè)凸(Degenerativelumbar scoliosis DLS)的相關(guān)性，從基因及分子水平研究退變性腰椎側(cè)凸的病因，為臨床分析退變性腰椎側(cè)凸的病因及預(yù)防提供依據(jù)。退變性腰椎側(cè)凸是指在骨骼發(fā)育成熟以后，在腰椎退變的基礎(chǔ)上發(fā)生的脊柱畸形，一般冠狀位Cobb角大于10度，但不超過40度

2、，多發(fā)生在50歲以上的中老年人。退變性腰椎側(cè)凸是一種立體的、復(fù)雜的旋轉(zhuǎn)畸形，隨著研究的進展，如生物力學(xué)，脊柱解剖的進一步認識，逐步發(fā)現(xiàn)退變性腰椎側(cè)凸不僅存在冠狀位上椎體的失平衡，還存在矢狀位上的椎體平衡的丟失和旋轉(zhuǎn)，多種畸形作用的結(jié)果導(dǎo)致腰背疼痛及下肢的神經(jīng)癥狀。目前，我國逐步進入老齡化社會，該病發(fā)病率逐年升高，是影響老年人的生活質(zhì)量的重要疾病。該病的發(fā)病原因復(fù)雜，具體機制尚不清楚，有研究證實了TNF-α與腰椎退變存在相關(guān)性，TNF-α

3、通過激活炎性介質(zhì)，介導(dǎo)炎性反應(yīng)，引起腰椎退變，但在TNF-α基因水平及其血清中含量與退變性腰椎側(cè)凸是否存在相關(guān)性，國內(nèi)外很少有報道。本研究通過聚合酶鏈式反應(yīng).限制性片段長度多態(tài)性方法(polymerase chain reaction restriction fragment polymorphisms assay，PCR-RFLP)及酶聯(lián)免疫吸附測定方法(enzyme linked immunosorbentassay，ELISA)檢

4、測TNF-α基因啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點上游第308位點單核苷酸多態(tài)性及其血清含量，探討此位點的多態(tài)性以及血清中TNF-α蛋白含量與北方漢族人群退變性腰椎側(cè)凸的關(guān)系。
　　方法：選取2009年10月至2011年12月于河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院脊柱外科門診及病房收治的60例退變性腰椎側(cè)凸患者作為研究對象，均行腰椎正側(cè)位X線及腰椎MRI檢查，選取同時期于該院進行健康體檢者60例作為正常對照組，兩組研究對象均系無血緣關(guān)系的北方漢族個體，在性別、年

5、齡、體重指數(shù)與病例組相匹配。收集兩組患者的外周新鮮血液，用小量全血基因組DNA快速提取試劑盒提取DNA，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)對兩組研究對象DNA標本TNF-α基因啟動子區(qū)特異性片段進行擴增，再應(yīng)用限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性(RFLP)技術(shù)對擴增的特異性片段用NcoⅠ進行酶切，產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳的方法進行檢測，分析其基因型及等位基因頻率的分布。用酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)(ELISA)，對兩組研究對象血清TNF-a蛋白水平進行檢測。

6、利用Adobe Photoshop6.0軟件，測量病例組MRI圖像中頂椎間盤及其上下椎間盤內(nèi)髓核與腦脊液T2加權(quán)像的相對信號強度，同時測量病例組正位X線片上的Cobb角。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，性別、體重指數(shù)、血清TNF-α含量比較采用t檢驗或方差分析。年齡、基因型及等位基因頻率等計數(shù)資料比較采用x2或Fisher精確概率法檢驗，血清TNF-α含量與椎間盤退變程度及Cobb角相關(guān)分析采用Linear correl

7、ate分析。
　　結(jié)果：兩組研究對象的年齡、性別、體重指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明在年齡、性別、體重指數(shù)方面匹配。TNF-α-308所在片段經(jīng)PCR擴增后目的片段的長度為107bp，酶切后有3種基因型，G/G基因型(87bp、20bp2條帶)，G/A基因型(107bp、87bp、20bp3條帶)，A/A基因型(107bp1條帶)。兩組研究對象各基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，研究對象具

8、有代表性。TNF-α308多態(tài)性位點G/G、G/A和A/A基因型頻率在病例組為分別為70.0％、26.7％和3.3％，對照組為86.7％、11.7％和1.7％，兩組基因型頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。G/G基因型頻率與非G/G基因型頻率(G/A、A/A)及等位基因G、A頻率在病例組為分別為70.0％、30.0％和83.3％、16.7％，對照組為86.7％、13.3％和92.5％、7.5％，兩組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05

9、)。相對危險度比較提示，非G/G基因型比G/G基因型患病的危險性增大(OR=3.245，95％CI=1.240～8.495)，A等位基因攜帶者比非A等位基因攜帶者患病的危險性增加(OR=2.467，95％CI=1.074～5.667)。細胞因子TNF-α血清濃度，病例組163.25±3.44ng/L，對照組51.12±0.92ng/L，兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且病例組顯著高于對照組。TNF-α血清濃度與髓核相對信號強度