人Ⅰ型精氨酸酶基因的克隆及表達.pdf

1、南京理工大學碩士學位論文人Ⅰ型精氨酸酶基因的克隆及表達姓名：鄭迎迎申請學位級別：碩士專業(yè)：生物化工指導教師：李大力20060601碩士論文 人I 型精氨酸酶基因的克隆及表達A b s t r a c tA r g i n a s e , w h i c h c o n v e r t s a r g i n i n e t O o r n i t h i n ea n d u r e a , i s a k i n d o f e n

2、z y m e i nu r e ac y c l e ．I tp l a y s a s i g n i f i c a n t r o l ei n N m e c h a b o l i s m ．A sa s e m i - n e c e s s a r ya m i n o a c i d ,a r g i n i n ei so n l y n e c e s s a r y f o rf a s t - g r o w

3、n t i s s u e , e s p e c i a l l yf o r t h e t u m o r t i s s u e ．S oa r g i n a s ec a n s e i n e 勰a na n t i c a r c i n o g e n i c a g e n t b y d e p r i v i n g o f a r g i n i n e , w h i c hd o e s m u c h m

4、 o r eh a r m t o c a n c e r c e l lt h a nt o n o r m a l t i s s u e ．T h eo b j e c t i v eo f t h i s p a p e r i st o c l o n e a n de x p r e s s h u m a n a r g i n a s e I g e n e O 認I ) w i t h m o l e c u l a

5、r c l o n i n g t e c h n i q u e ．T h e h A 1 w a g a m p l i f i e df r o m h u m a n l i v e rR N A b y R T - P C R , f o l l o w e d b y a r o u t i n es e q u e n c i n g a s s a y t oi d e n t i f yi t s n u c l e

6、i ca c i ds e q u e n c e ．T h e n t h es e q u e n c e w a s a n a l y z e da n dc o m p a r e d w i t h t h e d a t af r o m G e n e B a n k ．T h e r e s u l td e m o n s t r a t e d t h a th A 1 w a sa m p l i f i e d

7、 c o r r e c t l y ．T h e h A 1 w a s i n s e r t e di n t op P I C 9 K v e c t o rc o n t a i n i n gA O X l p r o m o t e ra n d a - f a c t o rs i g n a ls e q u e n c et oc o n s t r u c ta r e c o m b i n a n tp l a

8、 s m i dp P I C 9 K - h A I ．T h e np P I C 9 K - h A IW a s t r a n s f o r m e di n t oP i c h i a p a s t o r i sS M D l 1 6 8t oc o n s t r u c tr e c o m b i n a n t P i c h ／a p a s t o t q $s t r a i nS M D l 1 6

9、8 ( p P I C 9 K - h A I1 ．T h e r e c o m b i n a n t s t r a i nW i t si n d u c e db y O ．5 0 ／o m e t h a n 0 1 ．A f t e rb e i n gi n d u c e df o r1 2 0 h , n o e n z y m eW a sd e t e c t e di n s u p e r n a t a n

10、 tb ye i t h e re n z y m ea c t i v i t y a s s a y o rS D S - P A G E ．B u t t h ec e l l l y s a t es h o w e de n z y m ea c t i v i t y o f O ．3 7 2 Up e rg r a m c e l l s ( w e t w e i g h t ) ．T h e h A I W e s a

11、 l s oi n s e r t e d i n t op E T 3 0 a V C C t O fc o n t a i n i n gT 7 p r o m o t e r t oc o n s t r u c tar e c o m b i n a n tp l a s m i dp E T 3 0 a - h A I ．T h e n p E T 3 0 a - h A 1 w a s t r a n s f o r m e

12、 di n t oE c o l iB L 2 1 ( D E 3 ) t O c o n s t r u c t r e c o m b i n a n tEc o I i s t r a i n B L 2 1 ( D E 3 Xp E T 3 0 a - h A I1 ．T h er e c o m b i n a n ts t r a i nW a si n d u c e db yl m M I P T G ．W i t ht

13、 h ei n d u c t i o no fl m M 1 P T G f o r7 kt h eB L 2 1 ( D E 3 ) ( p E T 3 0 a - h A I1 s h o w e de n z y m ea c t i v i t y o f3 4 ．6 1 2p e rg r a mc e l l s ( w e tw e i g h t ) ．S D S —P A G Es h o w e d t h a t

14、 t h e m o l e c u l a r w e i g h t o f t h e p r o t c = i n e x p r e s s e d w a s a b o u t3 5 妨．w h i c h w a s a c e o r d a n t w i t h t h e t h e o r e t i c a lv a l u e ．K e y w o r d s ：h u m a n a r g i n a