基于真菌漆酶作用機制的結構改造及改性漆酶降解有機磷毒物的研究.pdf

1、目的:
　　1、通過研究真菌漆酶復合物中酶與配體的相互作用，進一步揭示其催化氧化機制。
　　2、基于降解實驗數據探索真菌漆酶降解有機磷毒物的規(guī)律和作用機制。
　　3、改造漆酶并預測改性漆酶降解有機磷毒物的效果，通過實驗制備理論預測效果好的改性漆酶。
　　方法:
　　1、從5個已知的真菌漆酶復合物的晶體結構出發(fā)，利用分子模擬技術和能量優(yōu)化方法，研究其在晶體結構和非晶體狀態(tài)下酶與配體的相互作用，在分子水平進一步

2、揭示其催化氧化機制。
　　2、基于文獻報道的降解實驗研究總結反應規(guī)律，并利用分子模擬技術和分子對接方法探索真菌漆酶降解有機磷毒物的機制。
　　3、在漆酶作用機制研究的基礎上，提出漆酶的分子改造策略，利用同源建模方法構建不同點突變漆酶的空間結構模型。
　　4、利用分子模擬技術和分子對接方法，理論預測改性漆酶降解有機磷毒物的效果。
　　5、利用酵母表達系統制備理論預測效果好的改性漆酶。
　　結果:
　　1

3、、在1KYA中與底物發(fā)生疏水作用的氨基酸殘基主要有Phe162、Leu164、Phe265、Pro391和Gly392，在2HRG中的主要有Val162、Phe331、Pro390和Gly391，在3FU7、3FU8和3FU9中的主要有Ala191、Pro192、Phe371、Phe427、Leu429。此外，底物結合到漆酶活性口袋后，其結構中富含電子的基團貼近其中保守的組氨酸，并且?guī)缀蹩偸桥c之形成氫鍵。
　　2、真菌漆酶與介質組

4、成的漆酶介質體系可以有效降解一類具有Ⅴ類神經毒劑結構特征的有機磷毒物，其中漆酶總是白腐菌漆酶，而介質是影響催化效率的重要因素。有機磷毒物中處在連接硫原子的β位碳原子上的氮原子具有十分重要的地位，它很可能在反應中首先失去電子。在中性溶劑中，它可能被氧化生成N-氧化物，這在水溶液中是穩(wěn)定的，但當存在有機溶劑時則會發(fā)生競爭性的分解反應。
　　3、本研究利用MOE-Dock模塊提供的分子對接功能探索真菌漆酶與底物對接的優(yōu)化條件發(fā)現:將分別

5、在Amber99力場和MMFF94x力場中進行加氫處理的酶和底物繼續(xù)在MMFF94x力場中進行對接、放置函數選用Triangle Matcher、打分函數選用London dG、優(yōu)化函數選用Forcefield、結果評估依據結合自由能，可以較好展現真菌漆酶與底物的相互作用。
　　4、真菌漆酶催化氧化一類具有Ⅴ類神經毒劑結構特征的有機磷毒物時，底物與酶活性口袋中的Phe162、Pro391、G1y392、Ala393等多個氨基酸殘基

6、發(fā)生疏水作用，底物的氮端貼近其中保守的組氨酸，底物的磷端處于活性口袋外側，并與Gly392形成氫鍵。
　　5、為了提升漆酶直接催化降解較難處理的有毒有害物的能力，本研究通過分析認為改造漆酶活性口袋中的氨基酸、增強兩者間的結合親和力是有效的改造策略。變色栓菌漆酶的來源和應用十分廣泛，而且其降解有機磷毒物的實驗也取得了很好的效果，是很有潛力的改造對象。
　　6、本研究利用MOE-Homology Model模塊提供的同源建模功能

7、構建1KYA突變結構的模型，建模試驗結果表明:設置模型打分函數為GB/Ⅵ、力場函數為Amber99，在建模完成后優(yōu)化處在高能角的氨基酸，可以構建較為可靠的突變漆酶結構模型。
　　7、本研究分別構建了變色栓菌漆酶的F162A突變、D206A突變、F265A突變、F332A突變、P391A突變、P391L突變和F162A/F332A突變的結構模型。分析所建模型的拉氏圖發(fā)現，高能角占該酶氨基酸總數的比例不超過0.6％而且均處在酶活性部位

8、外。除D206A突變和P391L突變外，突變漆酶的活性口袋均變大了，其中F265A突變、F332A突變和F162A/F332A突變顯著擴大了底物入口。
　　8、變色栓菌漆酶在發(fā)生F265A突變、F332A突變、P391A突變和P391L后與VX的結合自由能降低了，而在發(fā)生F162A突變、D206A突變和F162A/F332A突變后該參數升高了，其中變化最大的是P391A突變（大約降低了10％）。
　　9、改性漆酶與VX的結合

9、模式和未突變時相比并未發(fā)生顯著改變，底物與酶活性口袋中的Phe162、Pro391、Gly392、Ala393等多個氨基酸殘基發(fā)生疏水作用，底物的氮端貼近其中保守的組氨酸，底物的磷端處于活性口袋外側，可能與Gly392形成氫鍵。
　　10、變色栓菌漆酶在發(fā)生F162A突變、F332A突變、P391A突變和F162A/F332A突變后，活性口袋中組氨酸的NE2原子與VX中氮原子之間的距離大大減少了，從6.67(A)分別降至4.63(

10、A)、4.56(A)和4.45(A)和4.51(A)。
　　11、利用畢赤酵母GS115表達系統制備了含P391A突變變色栓菌漆酶的溶液4ml，實驗其濃度為0.24mg/ml。
　　結論:
　　1、疏水作用是影響漆酶底物和氧化產物交替與酶結合或釋放的重要影響因素。當底物結合到漆酶活性口袋后，其結構中富含電子的基團幾乎總是與活性口袋中保守的組氨酸形成氫鍵，這可能會提高電子從底物傳遞到漆酶T1Cu的效率，進而提高漆酶的催化

11、效率。
　　2、真菌漆酶與一類具有Ⅴ類神經毒劑結構特征的有機磷毒物發(fā)生相互作用時，底物與酶活性口袋中的Phe162、Pro391、Gly392、Ala393等多個氨基酸殘基發(fā)生疏水作用，這是兩者間的主要結合力;底物的氮端嵌入到活性口袋中，貼近其中的組氨酸，這可能會提高電子傳遞的效率;底物的磷端處于活性口袋外側，與Gly392形成氫鍵。
　　3、本研究分別構建了變色栓菌漆酶的F162A突變、D206A突變、F265A突變、F3