云芝（Trametes versicolor）1126產(chǎn)漆酶條件及漆酶同工酶性質(zhì)研究.pdf

1、木質(zhì)素是自然界中僅次于纖維素的第二大可再生資源，但其結(jié)構(gòu)復(fù)雜且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，難以被降解，一直無法被有效利用，已成為工業(yè)生產(chǎn)中重要的廢棄物和嚴(yán)重的環(huán)境污染物。木質(zhì)素的降解和利用也成為材料、能源、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域共同關(guān)注的熱門課題。白腐真菌是自然界中木質(zhì)素降解的主力軍，具有獨(dú)特的木質(zhì)素降解酶系和降解能力。其中漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，在木質(zhì)素降解過程中發(fā)揮著重要作用。 本研究通過菌株篩選，獲得一株高效的木質(zhì)素降解菌株Trametes

2、versicolor1126，在此基礎(chǔ)上系統(tǒng)研究了該菌株木質(zhì)素降解酶系的主要類群及其特征、胞外漆酶產(chǎn)生的條件和漆酶同工酶的分離純化、鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果如下： 1.從本實(shí)驗(yàn)室保藏的菌株中篩選到一株木質(zhì)素降解能力較強(qiáng)的菌株——T.versicolor1126，進(jìn)一步印證了T.versicolor1126在降解木質(zhì)素過程中其胞外酶——漆酶起著非常重要的作用，并且發(fā)現(xiàn)該菌株至少產(chǎn)生兩種漆酶同工酶。 2.通過單因子試驗(yàn)和正交分

3、析考察了影響T.versicolor1126產(chǎn)漆酶的因素，得到液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的最適培養(yǎng)基為：葡萄糖10.0g/L，酵母浸出汁7.0g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4·7H2O5.0g/L，CaCl2·2H2O1.0g/L，CuSO4·5H2O0.5mmol/L，吐溫-800.1％，愈創(chuàng)木酚1.0g/L，另加微量元素溶液7％，初始pH3.5。最佳培養(yǎng)條件為接種量5％(v/v)，溫度28℃，轉(zhuǎn)速150r/min。優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)5

4、d達(dá)到產(chǎn)酶高峰。 3.通過DEAE-SepharoseFastFlow柱層析和SephadexG-100柱層析，從T.versicolor1126發(fā)酵液中分離純化得到漆酶同工酶Lac1和Lac2，其中漆酶同工酶Lac1純化了53.88倍，得率為7％；Lac2純化了208.21倍，得率為29％。 4.原子吸收光譜顯示這兩種漆酶同工酶均含有Cu，蛋白質(zhì)氮端測(cè)序Lac1N-末端氨基酸序列為N-Gly-Ile-Gly，Lac2N

5、-末端氨基酸序列為N-Ala-Ile-Gly，證實(shí)這兩種同工酶屬于漆酶家族，蛋白質(zhì)肽指紋圖譜分析也支持這一結(jié)論。Lac1和Lac2的分子量分別為64.2kDa和60.7kDa。 5.漆酶Lac1的最適反應(yīng)pH3.5，最適作用溫度40℃，Lac1在pH3.0～4.5范圍內(nèi)較穩(wěn)定，剩余酶活力保持在80％以上，在50℃時(shí)剩余酶活還在80％以上。Ag+、Mn2+、Li+、Fe3+對(duì)Lac1有抑制作用，其中以Ag+、Mn2+的抑制作用最為

6、明顯，Cu2+、Zn2+對(duì)Lac1的酶活性有很弱的激活作用；Lac2的最適反應(yīng)pH4.0，最適作用溫度50℃，Ag+、Mn2+對(duì)Lac2也表現(xiàn)出抑制作用，Co2+、Zn2+、Cu2+對(duì)Lac2的活性有較強(qiáng)激活作用，其中Co2+的作用最為明顯。Lac1和Lac2的Km值分別為0.06896mmol/L和0.07692mmol/L；Vmax值分別為344.8mmol/mL/min和769.2mmol/mL/min。 T.versic