miRNA-296 在小鼠堿燒傷角膜新生血管中的表達(dá)和功能研究.pdf

1、角膜(Cornea)位于眼球前壁的一層透明膜，約占纖維膜的前1/6，從后面看角膜呈正圓形，正常的角膜是沒有血管，血管終止于角膜緣，但是由于致病因素在角膜緣形成血管網(wǎng)，并且部分新生血管進(jìn)入角膜內(nèi)，這個(gè)新生血管網(wǎng)被稱為角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)。新生血管是角膜活動(dòng)性炎癥的一個(gè)標(biāo)志，新生血管的發(fā)生發(fā)展取決于炎性刺激物的性質(zhì)，一旦血管離開了正常的血管網(wǎng)侵入到角膜，就是角膜血管翳。角膜的新生血管是

2、機(jī)體組織對各種侵致病因素的代償反應(yīng)，隨著它對感染的消除、創(chuàng)傷愈合、抑制免疫介導(dǎo)的角膜溶解有一定作用，但其結(jié)構(gòu)和功能不完善，容易發(fā)生血漿滲漏，造成角膜水腫、脂質(zhì)沉著以及激發(fā)的角膜瘢痕化，嚴(yán)重影響視力；也使角膜移植排斥反應(yīng)的發(fā)生率大大增加嚴(yán)重危害患者視力，抑制角膜新生血管的發(fā)生發(fā)展一直是眼科棘手的問題。miR296位于染色體20q13.32處，在全身的疾病及部分器官體外實(shí)驗(yàn)中，現(xiàn)已證實(shí)miR-296通過直接抑制其靶基因FGF23表達(dá)，可以促

3、進(jìn)新生血管的作用,有學(xué)者研究證實(shí)miR-296的分子作用是與新生血管生成有關(guān)，是一個(gè)較好的新生血管的抑制劑。但是目前在角膜新生血管與miRNA-296相關(guān)的研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)將通過二部分內(nèi)容來研究，第一部分：通過建立小鼠堿燒傷模型后明確 miR-296在角膜新生血管的表達(dá)；第二部分探討闡明 miR-296參與調(diào)控角膜血管新生的分子機(jī)制，為各種致病因素引起的角膜新生血管治療提供新的治療方法。
　　內(nèi)容：
　　BALB/C小鼠

4、78只，均由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供,重量為35~45g,全部為雄性;雙眼均為實(shí)驗(yàn)眼。堿燒傷后隨機(jī)將78只小鼠分為2個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對照組，實(shí)驗(yàn)組A:氯替潑諾混懸滴眼液+左氧氟沙星滴眼液；實(shí)驗(yàn)組B：他克莫司滴眼液+左氧氟沙星滴眼液；對照組C：滴左氧氟沙星滴眼液每日3次作為陰性對照，共觀察21天。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均于造模后1d開始，給予左氧氟沙星滴眼液點(diǎn)眼每日4次，連點(diǎn)三日。
　　第一部分：角膜新生血管的模型建立和miRNA296

5、在體外表達(dá)檢測
　　方法：
　　1.1采用裂隙燈顯微鏡下觀察：測量各實(shí)驗(yàn)組的小鼠角膜新生血管新生血管長度以計(jì)算新生血管化面積、記錄新生血管數(shù)。
　　1.2采用免疫組化染色法：檢測實(shí)驗(yàn)組的小鼠堿燒傷后不同時(shí)間點(diǎn)角膜新生血管VEFE在角膜新生血管的表達(dá)情況。
　　1.3采用qRT-PCR方法檢測BALB/C小鼠堿燒傷后不同時(shí)間點(diǎn)角膜新生血管miRNA-296的表達(dá)水平，明確小鼠堿燒傷后角膜新生血管miRNA296的動(dòng)

6、態(tài)表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　?。?）實(shí)驗(yàn)A組和B組的角膜新生血管發(fā)生較遲、生長緩慢、新生血管化面積小，和對照C組比較，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異性有顯著性（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)A組小鼠的角膜新生血管面積低于實(shí)驗(yàn) B組和對照 C組，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異性有顯著性（P＜0.05）
　?。?）免疫組化染色顯示：對照C組的角膜新生血管組織的VEGF表達(dá)較實(shí)驗(yàn)A組和實(shí)驗(yàn)B組明顯減少;實(shí)驗(yàn) B組的VEGF的表達(dá)較實(shí)驗(yàn)A組明顯減少;各組之間的差異性有

7、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　?。?）免疫組化染色VEGF的炎性細(xì)胞數(shù)結(jié)果顯示：角膜堿燒傷后7d，實(shí)驗(yàn)A組角膜新生血管組織出現(xiàn)VEGF炎性細(xì)胞數(shù)(13.23±3.09)；實(shí)驗(yàn)B組炎性細(xì)胞數(shù)（16.24±3.68）；對照C組的炎性細(xì)胞數(shù)(31.06±3.52)，各組之間的差異性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　(4) RT-PCR檢測角膜組織中miRNA296。在造模后各實(shí)驗(yàn)組和對照組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)A組低于

8、實(shí)驗(yàn)B組和對照C組，差異性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）
　　結(jié)論：
　　1）氯替潑諾混懸滴眼液可有效抑制堿燒傷小鼠角膜新生血管的增殖，并可減少角膜組織新生血管的生成。
　　2）他克莫司滴眼液雖然可以有效抑制堿燒傷后小鼠角膜新生血管的增殖，但是效果沒有氯替潑諾混懸滴眼液抑制角膜新生血管的增殖有效。
　　3）免疫組化染色結(jié)果顯示：角膜堿燒傷后7d，實(shí)驗(yàn)A組和B組的角膜新生血管組織出現(xiàn) VEGF炎性細(xì)胞數(shù)與對照 C組的

9、炎性細(xì)胞數(shù)是減少的，VEGF促進(jìn)堿燒傷小鼠角膜新生血管的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)激素和免疫抑制劑可以抑制VEGF的表達(dá)。
　　4） qRT-PCR結(jié)果顯示，角膜堿燒傷后可各時(shí)間點(diǎn)小鼠角膜新生血管的miR-296表達(dá)均低于正常角膜組織，(各P＜0.05)，miR-296在實(shí)驗(yàn)A組中角膜堿燒傷后第1天表達(dá)即開始下調(diào)(0.472997±0.136016)，第7天表達(dá)量繼續(xù)上調(diào)(0.452387±0.126035)，10天時(shí)最明顯(0.432532

10、±0.138526)，表明小鼠角膜堿燒傷后角膜新生血管存在 miR-296的表達(dá)，且堿燒傷可刺激 miR-296表達(dá)水平的逐漸下調(diào)。
　　第二部分：miR-296參與調(diào)控角膜血管新生的分子機(jī)制作用研究
　　方法：
　　2．1采用Western blot法檢測BALB/C小鼠堿燒傷后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠新生血管 FGF32的蛋白表達(dá)，明確小鼠堿燒傷后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠新生血管后 miR-296的靶基因FGF32的蛋白表達(dá)變化。

11、r>　　2.2通過芯片技術(shù)預(yù)測的miRNA296的靶基因，探討FGF23、VEGF、IL-6角膜新生血管的信號(hào)通路機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　(1), W-B檢測角膜組織中miRNA296的靶基因FGF23表達(dá)量。在造模后各實(shí)驗(yàn)組和對照組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的FGF32的蛋白表達(dá)量逐漸下調(diào)，實(shí)驗(yàn)A組低于實(shí)驗(yàn)B組和對照C組，差異性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）
　?。?）建立角膜新生血管的堿燒傷的模型，miR-296在實(shí)驗(yàn)組中堿燒傷大

12、鼠角膜新生血管角膜組織的表達(dá)量（0.245±0.024）較對照C組的角膜組織表達(dá)量(1.136±0.126)顯著下調(diào)(P＜0.01)。
　?。?） miRNA296在芯片技術(shù)檢測FGF23 mRNA的表達(dá)水平下降，其蛋白水平則顯著下降。與此同時(shí)，VEFE的 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)，而FGF23的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下降(各P＜0.05)
　?。?）通過芯片技術(shù)檢miRNA預(yù)測的靶基因與FGF23、VEGF、

13、IL-6血管生成信號(hào)通路有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1）Western-blot結(jié)果顯示檢測角膜堿燒傷后可各時(shí)間點(diǎn)小鼠角膜新生血管的1d，3d，7d實(shí)驗(yàn)組小鼠角膜新生血管的FGF23的蛋白表達(dá)逐漸下降，驗(yàn)證了小鼠角膜堿燒傷后角膜新生血管表達(dá)的miR-296可抑制其靶基因FGF23的蛋白表達(dá)。
　　2）采用 western blot法檢測 miR-296可上調(diào)角膜新生血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF-VEGFR信號(hào)通路，下調(diào)FGF23信