血管緊張素Ⅱ加速CKDApoE---小鼠動(dòng)脈粥樣硬化及其早、晚期炎癥機(jī)制.pdf

1、背景和目的:動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis, As）是慢性腎臟?。–hronic kidney disease, CKD）患者高發(fā)的心血管疾病（Cardiolvascular disease, CVD）。CKD可以加速 As的形成。既往的研究結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道，血管緊張素II（Angiotensin II, Ang II）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（Nicotinamide adenine dinucleotide ph

2、osphate oxidases, NOXs）均與CKD和As緊密相關(guān)。然而，仍然鮮有報(bào)道關(guān)注CKD加速As形成過(guò)程中，早期炎癥階段Ang II和NOXs在其中的相互作用和表現(xiàn)情況。運(yùn)用Ang II1型受體拮抗劑——氯沙坦，可以在動(dòng)物模型中觀察Ang II在整個(gè)As形成過(guò)程中的作用。本研究期望了解各個(gè)炎癥細(xì)胞和炎癥相關(guān)因子和蛋白在As形成過(guò)程中水平的變化，探討Ang II促血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)NOXs的表達(dá)時(shí)間依賴(lài)性和通路機(jī)制。

3、　　方法:
　　1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　?。?）用5/6腎切除法（5/6Nephrectomy,5/6Nx）構(gòu)建ApoE-/-小鼠CKD+As模型。
　　（2）將ApoE-/-小鼠分為3組，分別為假手術(shù)的對(duì)照組、5/6Nx組、5/6Nx+losartan組，建模手術(shù)結(jié)束2w后開(kāi)始予以5/6Nx+氯沙坦組小鼠15mg/kg/d劑量的氯沙坦灌胃，其余小鼠給予等體積的1%羧甲基纖維素鈉溶液。
　?。?）建模前、建模成功后、As

4、早期和As晚期分別取小鼠尾靜脈血測(cè)Scr、BUN、Ang II、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞比例、VCAM-1、CINC-1、MCP-1在外周血中的水平。
　?。?）連續(xù)灌胃4w后，隨機(jī)抽取各小組小鼠一半的數(shù)量摘取小鼠心臟標(biāo)本，制作主動(dòng)脈根部主動(dòng)脈瓣切片，胸主動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈留取用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blot檢測(cè)；剩余小鼠在繼續(xù)灌胃給藥16w后同上方法留取標(biāo)本待測(cè)。
　?。?）用HE染色法觀測(cè)小鼠主動(dòng)脈根部As斑塊形

5、成的情況，IHC法觀測(cè)主動(dòng)脈根部中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況，Ly6G標(biāo)記中性粒細(xì)胞、CD68標(biāo)記巨噬細(xì)胞，NOX1、NOX2、NOX4抗體標(biāo)記觀測(cè)主動(dòng)脈根部主動(dòng)脈管壁三種 NOXs蛋白的表達(dá)情況，主動(dòng)脈根部的各項(xiàng)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)用Image Pro Plus6.0進(jìn)行陽(yáng)性指標(biāo)面積的統(tǒng)計(jì)，計(jì)算陽(yáng)性指標(biāo)面積占血管壁橫截面積的比例，再用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　?。?）用PCR和WB方法檢測(cè)小鼠胸腹主動(dòng)脈NOX1、NOX2和NOX

6、4的mRNA和蛋白表達(dá)情況，并用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)
　?。?）用CCK-8法檢測(cè)適用于Ang II干預(yù)HUVECs實(shí)驗(yàn)的濃度。
　?。?）Ang II干預(yù)HUVECs10、20、30、40、50、60min和1、2、4、8、12、24h，運(yùn)用DHE和DCFH-DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞ROS的合成情況，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blot方法檢測(cè)NOX1、NOX2、NOX4的mR

7、NA和蛋白表達(dá)情況以及p-p38、p-ERK1/2、p-JNK的蛋白表達(dá)情況，干預(yù)HUVECs后留取的培養(yǎng)基上清液用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)上清液中IL-8、MCP-1、TNF-α、IL-6的水平。
　?。?）運(yùn)用apocynin輔助探究Ang II刺激HUVECs后各NOXs蛋白和MAPK通路的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.1 血清生化分析
　　5/6Nx的ApoE-/-小鼠外周血Sc

8、r、BUN、Ang II水平穩(wěn)定升高（P＜0.05），氯沙坦可降低5/6Nx組Ang II水平（P＜0.01）。
　　1.2 PBMCs免疫細(xì)胞和趨化因子水平
　?。?）5/6Nx組外周血中性粒細(xì)胞比例和趨化因子CINC-1均在As早期時(shí)呈一過(guò)性升高（P＜0.001），在As晚期下降，5/6Nx組水平低于對(duì)照組和5/6Nx+氯沙坦組（P＜0.05）。
　　（2）外周血單核細(xì)胞比例和趨化因子MCP-1在整個(gè)As形成過(guò)程呈

9、逐漸升高，晚期As達(dá)到最高（P＜0.05）。
　　1.3 小鼠主動(dòng)脈取材檢測(cè)結(jié)果
　?。?）HE染色結(jié)果可見(jiàn)5/6Nx組As斑塊較對(duì)照組As斑塊面積比例高，氯沙坦的持續(xù)干預(yù)可以部分抑制5/6Nx導(dǎo)致的斑塊形成速度和面積比例，但仍高于對(duì)照組。
　?。?）As早期5/6Nx組的NOX1、NOX2和NOX4的表達(dá)高于對(duì)照組，氯沙坦給藥4w可以部分抑制NOX1和NOX2的激活，但不能有效控制主動(dòng)脈中的NOX4表達(dá)水平（P＜0.

10、05）。
　?。?）As晚期5/6Nx組的NOX1和NOX2的表達(dá)仍較對(duì)照組高（P＜0.05），但予以氯沙坦持續(xù)干預(yù)16w仍能部分控制NOX1的表達(dá)，但不能有效控制NOX2的表達(dá)，As晚期三組小鼠主動(dòng)脈NOX4的表達(dá)無(wú)明顯差異（P＜0.05）。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　2.1 Ang II干預(yù)HUVECs早、晚期NOXs、ROS、MAPK的表達(dá)情況
　?。?）Ang II干預(yù)HUVECs10、20、30、40、

11、50、60min后，NOX1和NOX2的mRNA和蛋白表達(dá)在30和40min處達(dá)到最大合成量，NOX4的mRNA和蛋白表達(dá)在20和30min處達(dá)到最大合成量（P＜0.05）。Ang II干預(yù)HUVECs1、2、4、8、12、24h后，NOX1和NOX2的mRNA和蛋白表達(dá)在8h處達(dá)到最大合成量，NOX4的mRNA和蛋白表達(dá)在4h處達(dá)到最大合成量（P＜0.05）。
　?。?）Ang II干預(yù)HUVECs10、20、30、40、50、

12、60min后，O2·-的合成在30和40min處最高（P＜0.05），H2O2的合成在20和30min處最高（P＜0.05），作用HUVECs1、2、4、8、12、24h后O2·-和H2O2的合成組間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　?。?）Ang II干預(yù)HUVECs10、20、30、40、50、60min后p-p38、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表達(dá)最高時(shí)間段分別在30-40min、30min、20-30min。Ang II作用HUV

13、ECs1、2、4、8、12、24h后MAPK的三條通路的p-p38、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表達(dá)最高時(shí)間點(diǎn)分別在8h、8h、4h處（P＜0.05）。
　　（4）Ang II干預(yù)HUVECs，4h時(shí)細(xì)胞因子IL-8、MCP-1、TNF-α、IL-6合成分泌均達(dá)到最高水平(P＜0.001)。
　?。?）預(yù)處理apocynin后Ang II干預(yù)HUVECs，發(fā)現(xiàn)H2O2由NOX4經(jīng)JNK通路激活合成，O2·-主要由NOX1

14、和NOX2經(jīng)p38和ERK1/2通路激活合成。
　　結(jié)論:
　　1.5/6Nx加速ApoE-/-小鼠的主動(dòng)脈根部As斑塊形成，氯沙坦的持續(xù)干預(yù)可部分抑制斑塊形成速度和面積比例。
　　2.在As早期，氯沙坦可有效降低部分Ang II、VCAM-1、CINC-1、中性粒細(xì)胞比例水平和主動(dòng)脈NOX1、NOX2的表達(dá)水平。
　　3.在As晚期，Ang II并非主導(dǎo)As形成和持續(xù)加重的最主要因素。
　　4.Ang I