人Coactosin Like Protein及MICAL1 Calponin Homolgy結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、本論文的工作主要包括兩個(gè)蛋白質(zhì)(結(jié)構(gòu)域)的結(jié)構(gòu)和功能的研究。其中第一個(gè)蛋白質(zhì)是人的Coactosin Like Protein(CLP),我們通過NMR方法研究了它的溶液結(jié)構(gòu),并通過一系列點(diǎn)突變以及高速離心共沉降的方法研究了它與纖維狀肌動(dòng)蛋白F-actin的結(jié)合界面,在此基礎(chǔ)上,我們利用Docking的方法得到了hCLP與F-actin的結(jié)合模型。我們還通過主鏈動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)hCLP的β4-β5區(qū)域(殘基66-75)具有很大的柔性,而這

2、種柔性對(duì)于它與F-actin的相互作用是必需的。另一個(gè)是人的MICAL_1蛋白質(zhì)的Calponin Homology結(jié)構(gòu)域。我們利用NMR研究了它的三維結(jié)構(gòu),并推測(cè)了它的可能的功能。
　　本論文第一章是對(duì)含ADF-H結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)家族的一個(gè)綜述,ADF-H結(jié)構(gòu)域是一類肌動(dòng)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域,含該結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)在調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白在球狀肌動(dòng)蛋白單體(G-actin)與聚合的纖維狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)之間的周轉(zhuǎn)速度,調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白在不同形式

3、之間轉(zhuǎn)換,以及對(duì)于肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)的維持等方面都起著重要的作用。在這一章中,我們對(duì)含ADF-H結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的四個(gè)亞家族的結(jié)構(gòu)和功能等方面做了綜述。
　　在第二章中,我們利用NMR波譜學(xué),點(diǎn)突變,超速離心共沉降和docking等方法研究了hCLP的溶液結(jié)構(gòu)以及hCLP與F-actin的相互作用模型。hCLP是屬于含ADF-H結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的第四個(gè)亞家族。我們從人腦的cDNA文庫中通過PCR的方法獲得了hCLP的基因,并將其構(gòu)建到表達(dá)載

4、體中在大腸桿菌中得到表達(dá),利用Ni離子親和層析獲得可用于核磁實(shí)驗(yàn)的hCLP重組蛋白質(zhì)。在用異核多維核磁共振方法測(cè)定了hCLP的溶液結(jié)構(gòu)后,我們又設(shè)計(jì)了一系列突變,利用超速離心共沉降的方法研究了這些突變對(duì)它與F-actin的相互作用的影響,從而得到了hCLP與F-actin的作用界面,發(fā)現(xiàn)了前人未曾報(bào)導(dǎo)過的與F-actin結(jié)合相關(guān)的重要的殘基。同時(shí),我們利用計(jì)算機(jī)模擬的方法得到了一系列hCLP-F-actin的作用模型,并用突變的數(shù)據(jù)加以

5、篩選,最終得到一個(gè)可以信賴的模型。hCLP-F-actin復(fù)合物的模型與ADF-H家族的UNC-60B-F-actin的模型非常相似,唯一的區(qū)別在于hCLP的C末端并不參與F-actin的作用,而UNC-60B的C末端參與了與F-actin的相互作用。我們還通過主鏈動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)hCLP的β4-β5區(qū)域(殘基66-75)具有很大的柔性,而這種柔性對(duì)于它與F-actin的相互作用是必需的。通過hCLP-F-actin的復(fù)合物模型，我們解釋

6、了不同的ADF-H家族的蛋白質(zhì)為什么具有不同的G/F-actin結(jié)合的特性。
　　本論文第三章是對(duì)Calponin Homology結(jié)構(gòu)域的一個(gè)綜述，CH結(jié)構(gòu)域也是一類肌動(dòng)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，它只與纖維狀肌動(dòng)蛋白結(jié)合。它的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)比較特殊，與其它的F-actin相關(guān)蛋白質(zhì)，包括剪切、加帽或調(diào)節(jié)蛋白如gelsolin，ADF/cofilin,villin等有著顯著的不同，CH結(jié)構(gòu)域主要是螺旋為主的結(jié)構(gòu)，而其它肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白一般都是中間

7、有一個(gè)β折疊，兩邊被幾個(gè)α螺旋包圍的一種結(jié)構(gòu)模式。CH結(jié)構(gòu)域除了能與肌動(dòng)蛋白結(jié)合外，還表現(xiàn)為多樣化的功能，例如，可以與鈣調(diào)蛋白結(jié)合或者參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控等。
　　第四章的工作是關(guān)于人的MICAL_1的CH結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和功能研究。MICALs是一類功能很重要的蛋白質(zhì)，最初發(fā)現(xiàn)為可以與Cast相互作用，并因此而得名。后來，MICALs被發(fā)現(xiàn)可以在神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)，并且通過與神經(jīng)元的plexin A相互作用，參與到Semaphorin 1

8、a誘導(dǎo)的軸突排斥導(dǎo)向過程中。最近的研究還表明MICALs可以與rab1 GTP酶相互作用，參與囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。MICALs有很多結(jié)構(gòu)域，它的CH結(jié)構(gòu)域的功能還不清楚。因?yàn)镃H結(jié)構(gòu)域是一種蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用模塊，因此CH結(jié)構(gòu)域可能在plexin介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路過程中起著募集下游分子(比如細(xì)胞骨架蛋白)的作用。我們從人腦的cDNA文庫中通過PCR的方法獲得了MICAL_1 CH結(jié)構(gòu)域的基因，并將其構(gòu)建到表達(dá)載體中在大腸桿菌中得到表達(dá)，

9、利用Ni離子親和層析獲得可用于核磁實(shí)驗(yàn)的重組蛋白質(zhì)MICAL_1 CH。在解出MICAL_1 CH的溶液結(jié)構(gòu)后，我們通過NMR滴定實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)MICAL_1 CH不能和F-actin相互作用，通過序列比對(duì)，結(jié)構(gòu)比較，以及疏水表面的分析，我們解釋了它不與F-actin相互作用的原因。我們還通過GST pull down實(shí)驗(yàn)，對(duì)文獻(xiàn)中報(bào)道的MICAL_1 CH與vimentin相互作用提出了質(zhì)疑。最后，我們分析了MICAL_1 CH的可能的功