鴨源性傳染性支氣管炎病毒ZZ2004株全長cDNA感染性克隆的構(gòu)建.pdf

1、禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)以引起雞的呼吸道癥狀，腎臟損害，產(chǎn)蛋量和蛋的品質(zhì)下降為特征的冠狀病毒。鴨源性IBV ZZ2004是分離于以引起免疫抑制和生長抑制為主要癥狀的鴨群，感染肉仔雞群也引起同樣癥狀。本研究是在全基因組測序和序列分析基礎(chǔ)上，構(gòu)建IBV ZZ2004感染性cDNA克隆。為進(jìn)一步在分子水平上研究其基因組功能﹑病毒復(fù)制機(jī)制、分子致病機(jī)理以及發(fā)展新型疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　根據(jù)IBV ZZ2004毒株的全基因序列，借助DN

2、A Star軟件分析，選擇全長基因組核苷酸序列中單一限制性酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成4對引物，利用長距離RT-PCR方法，擴(kuò)增出4個 cDNA重疊片段， N1片段上游引入了 T7啟動子：N1(1nt~5954 nt)、N2(5860nt~12491nt)、N3(12434nt~20930nt)、N4(20717nt~27673nt)，分別克隆到pGEM-T easy載體上，通過JM109感受態(tài)細(xì)胞化學(xué)轉(zhuǎn)化，得到了4個不同的重組質(zhì)粒；4個重組質(zhì)粒

3、經(jīng)雙酶切鑒定和測序鑒定正確后，獲得了一個包括4個cDNA片段的IBV ZZ2004毒株全基因組 cDNA文庫。再利用限制性內(nèi)切酶分別對4個不同的重組質(zhì)粒和pFastBacHTA載體進(jìn)行雙酶切，分別回收，將4個片段中的兩兩重疊片段與pFastBacHTA載體在22℃水浴鍋中過夜連接，通過JM109感受態(tài)細(xì)胞化學(xué)轉(zhuǎn)化，得到了2個不同的重組質(zhì)粒，形成了只有2個大片段的IBV ZZ2004毒株全基因組cDNA文庫。最后利用限制性內(nèi)切酶分別對2個

4、不同的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，分別回收，在22℃水浴鍋中過夜連接，構(gòu)建IBV ZZ2004毒株全長cDNA文庫。根據(jù)IBV ZZ2004全基因序列，在全基因序列的前后兩端和中端設(shè)計(jì)三對特異性引物，用于鑒定全長是否連接成功。前端 G1片段的位置:1-476，長度：476nt；中端G2片段的位置：12245-12635，跨越鏈接位點(diǎn)，長度：391nt；末端G3片段的位置：27018-27673，長度：657nt，經(jīng)PCR鑒定IBV ZZ2004