Nec-1對(duì)鋁致癡呆模型認(rèn)知能力的影響及其作用機(jī)制.pdf

1、目的:通過(guò)用凋亡阻斷劑zVAD-fmk作為平行對(duì)照，來(lái)研究程序性壞死特異性阻斷劑Nec-1對(duì)鋁致癡呆模型小鼠的神經(jīng)行為改變及其對(duì)細(xì)胞死亡方式的影響。
　　 方法:取健康6月齡雄性昆明小鼠120只，分三批，第一批4個(gè)劑量組分別為：染鋁對(duì)照組(0.5％ALCl3)、2Mm、4mM、8mM Nec-1組；第二批4個(gè)劑量組分別為：染鋁對(duì)照組、75ng/2μl、150ng/2μl、300ng/2μlzVAD組；第三批4個(gè)劑量組分別為：染鋁

2、對(duì)照組、4mM Nec-1組、300ng/2μlzVAD組、Nec-1+zVAD組。連續(xù)5天每天1次側(cè)腦室注射上述液體，其中鋁溶液3μl/只/天、Nec-1和zVAD均為2μl/只/天。染毒期結(jié)束后第15天進(jìn)行Morris水迷宮試驗(yàn)；染毒期結(jié)束后第20天處死小鼠，取腦，切取一半大腦浸泡在10％福爾馬林中固定24h，做病理切片，進(jìn)一步做HE染色、硫堇染色及RIP1的免疫組化；另一半大腦分離出海馬做電鏡，皮層置于EP管中，-70℃保存，用于

3、Western-blot法檢測(cè)NF-κB、LC3-II、Caspase3及RIP1的蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:①小鼠學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試：在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，不同濃度Nec-1作用于染鋁模型小鼠后，與染鋁溶劑對(duì)照組相比，在4天的定位航行實(shí)驗(yàn)中，4mM組和8mM組逃避潛伏期顯著縮短(P＜0.01)，在第5天的空間搜索實(shí)驗(yàn)中，2mM、4mM組和8mM組原平臺(tái)象限停留時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P＜0.01)；不同濃度Z-VAD-FMK作用于

4、染鋁模型小鼠后，與染鋁溶劑對(duì)照組相比，在4天的定位航行實(shí)驗(yàn)中，高劑量組逃避潛伏期顯著縮短(P＜0.01)，在第5天的空間搜索實(shí)驗(yàn)中，低、中、高劑量組原平臺(tái)象限停留時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P＜0.01)；Nec-1、zVAD聯(lián)合作用于染鋁模型小鼠后，與染鋁溶劑對(duì)照組相比，在4天的定位航行實(shí)驗(yàn)中Nec-1組和Nec-1+zVAD組逃避潛伏期顯著縮短(P＜0.05)，在第5天的空間搜索實(shí)驗(yàn)中Nec-1+zVAD組原平臺(tái)象限停留時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P＜0.05

5、)。②HE染色及硫堇染色病理組織學(xué)結(jié)果：不同濃度Nec-1、zVAD作用于染鋁模型小鼠大腦皮質(zhì)及海馬CA3區(qū)病理改變顯示：染鋁溶劑對(duì)照組小鼠皮質(zhì)區(qū)可見(jiàn)核周及胞漿空泡變性、個(gè)別細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞以及細(xì)胞輪廓模糊，海馬區(qū)細(xì)胞數(shù)量少，出現(xiàn)細(xì)胞連接松解，細(xì)胞核固縮等，部分細(xì)胞出現(xiàn)壞死表現(xiàn)，胞核聚集、濃縮、溶解等，在顆粒層中可見(jiàn)零星輕微損傷細(xì)胞，主要表現(xiàn)為細(xì)胞核被染為深藍(lán)色、胞漿深紅色，出現(xiàn)核周輕度空泡變性，隨著Nec-1、zVAD劑量的升高，上述形態(tài)

6、學(xué)改變逐漸減弱；Nec-1、zVAD聯(lián)合作用于染鋁模型小鼠大腦皮質(zhì)及海馬CA3區(qū)病理改變顯示：Nec-1組和zVAD組上述形態(tài)學(xué)改變有所緩解，Nec-1+zVAD組少見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)異常，且細(xì)胞數(shù)量明顯增多，排列也較規(guī)則。③死亡相關(guān)蛋白的檢測(cè)：Western blot法檢測(cè)不同濃度Nec-1作用于染鋁模型小鼠后其大腦皮質(zhì)內(nèi)caspase3的蛋白表達(dá)呈下降趨勢(shì)，中、高劑量組caspase-3的蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著降低，且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜O

7、.01)；LC3-II的蛋白表達(dá)也呈下降趨勢(shì)，且低、中、高劑量組較對(duì)照組顯著降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜O.01)；NF-κB的蛋白表達(dá)也基本呈下降趨勢(shì)，但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞O.05)；RIP的蛋白表達(dá)也基本呈下降趨勢(shì)，且中劑量組較對(duì)照組顯著降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜O.05)。不同濃度zVAD.fmk作用于染鋁模型小鼠，Western-blot法檢測(cè)其大腦皮質(zhì)內(nèi)caspase3的蛋白表達(dá)呈下降趨勢(shì)，高劑量組caspase3的蛋白

8、表達(dá)較對(duì)照組顯著降低，且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜O.01)，LC3-II的蛋白表達(dá)呈增加趨勢(shì)，且中、高劑量組較對(duì)照組顯著增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜O.01)，NF-κB的蛋白表達(dá)呈下降趨勢(shì)，且低、中、高劑量組較對(duì)照組顯著降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜O.01)，RIP1的蛋白表達(dá)呈增加趨勢(shì)，且中、高劑量組較對(duì)照組顯著增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜O.01)。Nec-1、zVAD聯(lián)合作用于染鋁模型小鼠，Western-blot法檢測(cè)其大腦皮質(zhì)

9、內(nèi)caspase3的蛋白表達(dá)呈下降趨勢(shì)，且Nec-1組、zVAD組及Nec-1+zVAD組的caspase3的蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著降低，且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜O.01)，LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)Nec-1組較溶劑對(duì)照組有降低趨勢(shì)，zVAD組較對(duì)照組則增加趨勢(shì)，Nec-1+zVAD組較對(duì)照有增加趨勢(shì)，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞O.05)，但zVAD組較Nec-1組的升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜O.05)，NF-κB的蛋白表達(dá)Nec-1、zVAD組較溶

10、劑對(duì)照組有增加趨勢(shì)，且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜O.01)，zVAD組較Nec-1組則呈降低趨勢(shì)，且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜O.01)，Nec-1+zVAD組較對(duì)照有降低趨勢(shì)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜O.05)，RIP1的蛋白表達(dá)Nec-1組較溶劑對(duì)照組有降低趨勢(shì)，且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜O.01)，zVAD組較對(duì)照組則增加趨勢(shì)，且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜O.01)，Nec-1+zVAD組較對(duì)照有降低趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞O.05)。