膜蛋白Presenilin 1影響心力衰竭機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　PS1基因突變體在擴(kuò)心病家系中被發(fā)現(xiàn)，但是PS1基因在心臟心力衰竭病理過(guò)程中具體的作用機(jī)理并不清楚。本實(shí)驗(yàn)以條件性PS1基因敲除心力衰竭小鼠模型為研究對(duì)象，分別從形態(tài)和功能方面，研究生理和病理?xiàng)l件下PS1基因在心臟發(fā)育中的作用以及在心肌細(xì)胞中調(diào)控鈣穩(wěn)態(tài)的作用機(jī)制，從而更深入的了解PS1基因突變體在心力衰竭病理過(guò)程中的作用。
　　方法:
　　(1)條件性PS1基因敲除小鼠的建系:PS1的LoxP小鼠與Smo2

2、-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，獲得心臟和血管平滑肌條件性PS1基因敲除小鼠，出生20天后鑒定基因型。
　　(2)實(shí)驗(yàn)分組:將野生型小鼠隨機(jī)分為2組，每組60只，分別為假手術(shù)組(W)和心力衰竭組（W-HF）;將條件性PS1基因敲除小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(KO)和心力衰竭組(KO-HF);
　　(3)心力衰竭模型的制備:結(jié)扎小鼠心臟冠狀動(dòng)脈左前降支構(gòu)建心力衰竭小鼠模型，假手術(shù)組小鼠只穿線不結(jié)扎，其余步驟均相同。4周以后分別檢測(cè)小鼠存活率

3、、心重比和心功能等各項(xiàng)指標(biāo);
　　(4)心臟組織顯微和超微結(jié)構(gòu)檢測(cè):取小鼠心臟，4％多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色后，進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)觀察。取小鼠左心室，切成1mm3小塊，4％多聚甲醛固定，常規(guī)包埋、切片、染色后，進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察。
　　(5)心肌細(xì)胞中鈣穩(wěn)態(tài)檢測(cè):采用酶解法分離單個(gè)左心室心肌細(xì)胞，F(xiàn)luo-3/AM和Fluo-5N/AM負(fù)載心肌細(xì)胞，利用激光掃描共聚焦顯微鏡分別檢測(cè)咖啡因誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中的鈣瞬變、SR

4、中鈣容量以及CCE的變化;
　　(6)蛋白表達(dá)量的檢測(cè):提取各組小鼠左心室心肌組織膜蛋白，采用western blot法測(cè)定蛋白表達(dá)量的變化，并進(jìn)行蛋白表達(dá)量半定量分析;
　　(7)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，全部數(shù)值均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組間均數(shù)之間首先采用單因素方差分析（ANOVA）比較方差顯著性差異，如存在顯著性差異，各組間兩兩比較時(shí)采用LSD法，認(rèn)為P＜0.05具

5、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　(1)條件性PS1基因敲除小鼠的鑒定:與野生型小鼠相比，心肌組織中PS1蛋白表達(dá)量明顯降低(1.000±0.432 VS0.409±0.768，P＜0.01，n=3)。
　　(2) PS1基因敲除后小鼠成活率分析:在生理和病理狀態(tài)，PS1基因敲除小鼠的成活率明顯降低(Log Rank P＜0.05)。
　　(3) PS1基因敲除后對(duì)小鼠心功能分析:結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支后小鼠射血分?jǐn)?shù)

6、和縮短分?jǐn)?shù)明顯降低(P＜0.01，n=12)。與W組相比，KO組小鼠射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)明顯升高(EF:65.568±5.5939 VS72.411±5.2133，P＜0.05; FS:35.349±4.276 VS40.900±4.5166，P＜0.05); W-HF組射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)都高于KO-HF組(EF:28.821±8.3101 VS17.461±9.8133，P＜0.05; FS:13.842±4.4160VS8.072±4

7、.790，P＜0.05)。PS1基因敲除小鼠結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支后室間隔厚度明顯變薄(1.396±0.1124VS0.7267±0.3892，P＜0.01)。
　　(4) PS1基因敲除后對(duì)小鼠心重指數(shù)分析:與W組相比，KO組心重指數(shù)明顯增加(0.0059±0.0004 VS0.0063±0.0006，P＜0.05); KO-HF組和W-HF組之間沒(méi)有明顯差異(P＞0.05)。
　　(5)PS1基因敲除對(duì)小鼠顯微結(jié)構(gòu)和超微結(jié)

8、構(gòu)的影響:PS1基因敲除以后小鼠左心室壁和室間隔明顯增厚，室腔減小，小鼠室間隔和左心室心肌細(xì)胞排列疏松;W-HF組和KO-HF組大量心肌細(xì)胞死亡、室壁變薄、室腔明顯增大、大量心肌細(xì)胞纖維化，且KO-HF組病理特征更加明顯。在超微結(jié)構(gòu)層面:PS1基因敲除后心血管平滑肌排列紊亂，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，出現(xiàn)較多囊泡;W組心肌細(xì)胞中線粒體結(jié)構(gòu)完整，嵴結(jié)構(gòu)清晰，肌絲排列整齊有序，閏盤連接正常;KO組少部分肌絲出現(xiàn)溶解、斷裂現(xiàn)象，肌絲之間排列較為疏

9、松;與W組和W-HF組相比，KO組和KO-HF組心肌細(xì)胞中線粒體面積增加(P＜0.05，P＜0.01)，并且發(fā)現(xiàn)PS1基因缺失后心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體形狀以圓形居多，而W組和W-HF組則以橢圓形居多(0.0054±0.0013 VS0.0048±0.0012, P＜0.05;0.0083±0.0022VS0.0049±0.0017, P＜0.01)。KO-HF組心肌細(xì)胞閏盤間距增加并有斷裂現(xiàn)象，血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，肌絲之間排列較為疏松;W-HF

10、組和KO-HF組心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重并且出現(xiàn)嵴溶解、線粒體腫脹、肌絲纖維溶解斷裂、細(xì)胞纖維化和崩解等現(xiàn)象。
　　(6) PS1基因?qū)π∈笮募〖?xì)胞SR內(nèi)鈣容量的影響:使用Fluo-5N/AM孵育細(xì)胞后，W組熒光強(qiáng)度明顯高于PS1基因敲除組(45.417±2.939VS36.325±2.866，P＜0.01，n=12)。W-HF組的熒光強(qiáng)度也高于KO-HF組(24.908±2.3801 VS19.342±2.6869, P＜0.

11、01, n=12)。
　　(7)使用Fluo-3/AM負(fù)載心肌細(xì)胞，與假手術(shù)組相比，PS1基因敲除組小鼠咖啡因誘導(dǎo)的鈣瞬變明顯減弱(46.300±5.4057 VS29.861±7.0094，n=12，P＜0.01);與W-HF組相比，KO-HF咖啡因誘導(dǎo)的鈣瞬變明顯減弱(26.861±4.0650 VS18.984±4.0650，n=12，P＜0.05)，并且PS1基因敲除后小鼠鈣離子釋放速率明顯降低。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PS1基因缺失后，

12、SR內(nèi)的鈣離子含量和鈣離子釋放速率都明顯降低。靜息期檢測(cè)小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)鈣火花的發(fā)生率，發(fā)現(xiàn)KO組鈣火花的發(fā)生率明顯高于W組(9.109±4.990 VS16.118±5.9169，P＜0.01，n=12)，W-HF組和KO-HF組的鈣火花發(fā)生率也明顯升高(19.6947±4.668 VS24.742±4.0223, P＜0.05)。
　　(8) PS1基因?qū)π∈笮募〖?xì)胞內(nèi)CCE通路的影響:PS1基因敲除后，小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)CCE明顯

13、增強(qiáng)，
　　結(jié)論:
　　PS1蛋白對(duì)維持正常心功能具有重要的作用，其具體表現(xiàn)如下:
　　(1)PS1基因缺失影響小鼠心臟的發(fā)育，表現(xiàn)為左心室室壁和室間隔增厚，室腔減小，心肌細(xì)胞之間排列松弛，心肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)異常，誘導(dǎo)心肌重構(gòu)的發(fā)生。
　　(2)條件性PS1基因敲除小鼠在結(jié)扎心臟左前降支條件下更容易發(fā)展為心力衰竭癥狀，主要表現(xiàn)為室壁變薄，室腔增大，顯微及超微結(jié)構(gòu)異常，SR中鈣容量減少。最終使心肌收縮力減弱，心功能異常