凡納濱對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病致病原分析及防控技術(shù)研究.pdf

1、對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病（acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND）致病性強(qiáng)、死亡率高、傳播范圍廣，是目前危害對(duì)蝦養(yǎng)殖最嚴(yán)重的疾病之一。2009年以來急性肝胰腺壞死病在全國(guó)沿海地區(qū)的對(duì)蝦養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)頻繁發(fā)生，其排塘率高達(dá)80％以上，對(duì)我國(guó)對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)影響深重，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。
　　本實(shí)驗(yàn)旨在通過以口服細(xì)菌的方法進(jìn)行人工感染實(shí)驗(yàn)，分析了從患病對(duì)蝦病灶處分離的五株潛在致病菌的致病力，確定了四株

2、細(xì)菌為凡納濱對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病的致病原；同時(shí)，研究了四種消毒劑對(duì)四種病原菌的殺滅濃度、殺滅時(shí)間及殺滅率的關(guān)系，篩選出一種高效、綠色消毒劑聚六亞甲基胍（PHMG）；應(yīng)用候選高效抗菌素“HPP-1”（20%氟苯尼考）和PHMG，建立對(duì)蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)弧菌的定量化控制技術(shù)，在全國(guó)沿海多地對(duì)蝦主產(chǎn)區(qū)進(jìn)行AHPND的預(yù)防及治療中試實(shí)驗(yàn)。
　　1、五株急性肝胰腺壞死病潛在致病菌的致病力分析
　　課題組在浙江、江蘇、山東、河北、天津等地患

3、AHPND對(duì)蝦病灶處分離五株優(yōu)勢(shì)菌株 PV130715A、PV130903A、PV140731A、PV150526A、PV140821A，利用早期分離的上述五株細(xì)菌分別以口服方法進(jìn)行人工回接感染實(shí)驗(yàn)。以5.89～58915.94cell/g對(duì)蝦的總細(xì)菌數(shù)量，通過連續(xù)口服3d含菌餌料（每天一次）的方法統(tǒng)計(jì)分析凡納濱對(duì)蝦累積死亡率及感染對(duì)蝦的發(fā)病癥狀，對(duì)五株潛在致病菌的致病力進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，經(jīng)人工回接感染證實(shí)，其中四株細(xì)菌可引起健康對(duì)

4、蝦致病，其感染癥狀與自然發(fā)病的AHPND典型癥狀相似；并從感染對(duì)蝦病灶處重新分離出四株優(yōu)勢(shì)菌株P(guān)V130903B、PV140731B、PV150526B、PV140821B，通過生理生化及16S rDNA分子鑒定表明PV130903A與PV130903B為同一株菌，鑒定為副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）；PV140731A與PV140731B為同一株菌，鑒定為哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）；PV15

5、0526A與PV150526B為同一株菌，鑒定為溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）；PV140821A與PV140821B為同一株菌，鑒定為Vibrio sp.Ex25。根據(jù)科赫法則、發(fā)病癥狀、病理特征，確定了副溶血弧菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌、Vibrio sp.Ex25是AHPND的致病原。按照寇氏法則計(jì)算這四株病原菌的LD50分別為1.8×105cfu/g、8.5×104cfu/g、2.3×105cfu/g和2.9

6、×105cfu/g。對(duì)凡納濱對(duì)蝦而言，哈維氏弧菌的致病力高于副溶血弧菌、溶藻弧菌、Vibrio sp.Ex25。而PV130715A是嗜水氣單胞菌，并非AHPND的致病原。
　　2、幾種消毒劑對(duì)養(yǎng)殖對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病致病菌的殺滅實(shí)驗(yàn)研究
　　筆者對(duì)分離鑒定的副溶血弧菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌、Vibrio sp.Ex25四株致病菌進(jìn)行了定性及定量殺菌實(shí)驗(yàn)，研究了聚六亞甲基胍（PHMG）、雙氧水（H2O2）、聚維酮碘（PVPI

7、）及二氧化氯（ClO2）四種消毒劑對(duì)四株致病菌的殺滅濃度、殺滅時(shí)間及殺滅率的比較分析。結(jié)果表明，在24h內(nèi)的殺菌濃度上，濃度為0.5μl/L的PHMG可將副溶血弧菌、哈維氏弧菌、Vibrio sp.Ex25三株細(xì)菌全部殺滅，濃度為1μl/L的PHMG可將四株細(xì)菌全部殺滅；濃度為0.5μl/L的雙氧水可將Vibrio sp.Ex25殺滅，濃度為1μl/L的雙氧水可將四株病原菌全部殺滅；濃度為6μl/L的聚維酮碘可將副溶血弧菌、Vibrio

8、 sp.Ex25殺滅，濃度為8μl/L的聚維酮碘可將四株細(xì)菌全部殺滅；濃度為2μl/L的二氧化氯可將四株細(xì)菌全部殺滅。在殺菌時(shí)間上，10min內(nèi)，PHMG和雙氧水殺滅副溶血弧菌、哈維氏弧菌、Vibrio sp.Ex25的最低濃度均為1μl/L，二氧化氯殺滅副溶血弧菌、哈維氏弧菌、Vibrio sp.Ex25的最低濃度為2μl/L，而聚維酮碘需高達(dá)10μl/L才能完全殺滅四種細(xì)菌；在1h內(nèi)，濃度為2μl/L的二氧化氯可完全殺滅四種細(xì)菌；在

9、2h內(nèi)，濃度為1μl/L的PHMG和雙氧水可完全殺滅四種細(xì)菌。隨著時(shí)間的推移，PHMG和聚維酮碘顯示出持續(xù)殺菌的能力，殺菌率隨時(shí)間的推移逐漸升高，雙氧水和二氧化氯的殺菌率在達(dá)到峰值之后均有不同程度的下降，濃度越高，其到達(dá)峰值殺菌率的時(shí)間越短。綜合比較分析，這四種消毒劑對(duì)AHPND致病菌的殺菌能力強(qiáng)弱為PHMG＞雙氧水＞二氧化氯＞聚維酮碘。結(jié)合消毒劑的殺菌濃度、殺菌效果、持續(xù)時(shí)間及使用成本等幾個(gè)方面考慮，認(rèn)為PHMG具有綠色、安全、高效等

10、優(yōu)點(diǎn)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中將會(huì)有良好的應(yīng)用前景。
　　3、候選藥物對(duì)養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)弧菌的殺滅效果及養(yǎng)殖應(yīng)用示范
　　本研究采用口服專用藥物“HPP-1”殺滅對(duì)蝦肝胰腺弧菌和潑灑水體消毒劑聚六亞甲基胍（PHMG）殺滅養(yǎng)殖水體中弧菌相結(jié)合的方法，在天津、河北、江蘇、浙江、山東等多地的12處養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行了AHPND的預(yù)防及治療中試實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示：在疾病預(yù)防實(shí)驗(yàn)中，PHMG在0.5μl/L濃度作用下弧菌總量第4d下降到最低值，下降總量為初始值的8

11、0.84%；PHMG在1μl/L濃度下第3d弧菌總量下降到最低值，下降總量為85.67%；PHMG在2μl/L濃度下第第3d下降到最低值，下降總量為88.60%；在治療實(shí)驗(yàn)中，PHMG在0.5μl/L濃度作用下弧菌總量第3d下降到最低值，下降總量為65.25%；PHMG在1μl/L濃度下第3d弧菌總量下降到最低值，下降總量為62.29%；PHMG在2μl/L濃度下第3d下降到最低值，下降總量為87.05%。施用一次PHMG，濃度在0.5

12、~2μl/L范圍內(nèi)，第11d池塘水體內(nèi)弧菌總量仍低于初始值。通過口服專用藥物“HPP-1”藥餌（劑量6g/kg飼料，連續(xù)投喂5d），實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦肝胰腺內(nèi)可培養(yǎng)弧菌總數(shù)直線下降；投喂3d后，各實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦肝胰腺內(nèi)弧菌總數(shù)的殺滅率達(dá)99%以上；投喂藥餌5d后停藥，然后從第6d（停藥1d后）開始，各實(shí)驗(yàn)組肝胰腺內(nèi)弧菌總數(shù)呈緩慢增長(zhǎng)，直到第15d（停藥10d后）對(duì)蝦肝胰腺內(nèi)的弧菌總數(shù)仍然大大低于初始值。
　　對(duì)蝦養(yǎng)殖收獲的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：在AH

13、PND的預(yù)防實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組11口土塘、9口小棚，未見AHPND暴發(fā)，發(fā)病率為0%，最終土塘養(yǎng)殖模式下對(duì)蝦產(chǎn)量分別為：128kg/畝（規(guī)格24只/kg，F(xiàn)CR1.03）和304.5kg/畝（規(guī)格54只/kg，F(xiàn)CR1.02）；小棚養(yǎng)殖模式下對(duì)蝦產(chǎn)量767kg/畝（規(guī)格52只/kg，F(xiàn)CR1.06）；對(duì)照組中，5口土塘均暴發(fā)AHPND，全部死亡后排塘處理；8口小棚其中6口暴發(fā)AHPND，發(fā)病率75%。
　　在AHPND的治療實(shí)驗(yàn)中，實(shí)

14、驗(yàn)組59口土塘、10口小棚、85口高位池、63口室內(nèi)工廠化養(yǎng)殖池中治愈了53口土塘、10口小棚、60口高位池、63口室內(nèi)工廠化養(yǎng)殖池，治愈率約86.92%；最終土塘產(chǎn)量109kg/畝~370kg/畝，F(xiàn)CR1.02~1.05；小棚產(chǎn)量567kg/畝，F(xiàn)CR1.08；高位池產(chǎn)量2109.75kg/畝以上，F(xiàn)CR0.97~1.09；室內(nèi)工廠化產(chǎn)量7.9kg/m2，F(xiàn)CR1.18。未采取治療措施的對(duì)照組均暴發(fā)AHPND而排塘處理。