穿膜肽攜帶的目的蛋白穿膜效應(yīng)的研究.pdf

1、生物大分子在許多疾病的治療中發(fā)揮著重要作用，如超氧化物岐化酶(SOD)和過氧化物酶(CAT)、VEGF、糖尿病特效藥胰島素、抑癌基因表達(dá)的抑制腫瘤細(xì)胞生長或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的抑瘤蛋白p53、p27等。由于細(xì)胞膜的天然屏障作用，只有分子量小于600Da的小分子化合物、非極性疏水性的、脂溶性的，或細(xì)胞膜上有其載體的有機(jī)物才能穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。使得這類有治療價(jià)值但無細(xì)胞膜穿透性且易降解的親水性分子在細(xì)胞生物學(xué)、藥學(xué)等研究領(lǐng)域中的應(yīng)用大大受

2、到限制。多年來，研究人員致力于探索將這些效應(yīng)分子導(dǎo)入活細(xì)胞的有效方法。常用的方法有電穿孔、顯微注射、改變大分子物質(zhì)的物理和化學(xué)性狀、基因轉(zhuǎn)染、顆粒(如脂質(zhì)體)包裹法和細(xì)胞融合技術(shù)等。盡管這些方法各有優(yōu)勢(shì)，但都存在著操作復(fù)雜、效率不高和難于調(diào)控等問題。 近年來，相繼發(fā)現(xiàn)了一些具有細(xì)胞穿透功能的氨基酸序列，長度為幾個(gè)至幾十個(gè)氨基酸不等，多數(shù)小于20個(gè)氨基酸，被命名細(xì)胞穿膜肽(cell-penetratingpeptides，CPPs

3、)。細(xì)胞穿膜肽也被稱之為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(proteintransductiondomain,PTD)，或Trojanhorsepeptides，可以有效地將蛋白、多肽、核酸片段通過無受體介導(dǎo)、無耗能的方式，導(dǎo)入多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，且在一定濃度范圍內(nèi)不會(huì)造成細(xì)胞損傷。CPPs的發(fā)現(xiàn)為生物大分子用于疾病治療帶來了曙光，在細(xì)胞生物學(xué)、基因治療、藥物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、臨床藥效評(píng)價(jià)及細(xì)胞免疫學(xué)等研究領(lǐng)域均具有良好的應(yīng)用前景。細(xì)胞穿膜肽有天然存在和人工合成兩大類

4、，細(xì)胞穿膜肽的研究始于1988年，Green和Frankel分別證實(shí)HIV-1的反式激活蛋白Tat能跨膜轉(zhuǎn)移入細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)。1997年，Vives等發(fā)現(xiàn)HIV-TAT中一個(gè)富含堿性氨基酸、帶正電荷的多肽片斷與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能密切相關(guān)天然存在的CPPs。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的有三種，分別來自果蠅同源異型域ANTP、單純皰疹病毒1型(HSV-1)VP22轉(zhuǎn)錄因子以及HIV-1和SIV(2，3)的Tat。這些細(xì)胞穿膜肽均為帶有正電荷的長短不等的多肽片

5、段，其中富含精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸殘基。利用這一特性，人工合成的多聚精氨酸、賴氨酸，也具有穿膜活性，且9個(gè)精氨酸和9個(gè)賴氨酸殘基構(gòu)成的基序比TatPTD的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)活性還要強(qiáng)。經(jīng)過對(duì)天然存在的CPPs的結(jié)構(gòu)研究Morris小組設(shè)計(jì)合成了21個(gè)氨基酸殘基的兼性肽段PEP-1(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV)，PEP-1不同于天然CPPs，無需共價(jià)鍵與目的大分子相連即可發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)外源大分子的作用，可以轉(zhuǎn)運(yùn)天然構(gòu)像蛋白高效進(jìn)入細(xì)胞

6、，這大大改善了以往的CPPs只能高效轉(zhuǎn)運(yùn)變性蛋白的缺憾。綠色熒光蛋白(Greenfluorescenceprotein，GFP)由238個(gè)氨基酸組成，分子量為27kD，在395nm波長光的激發(fā)下可以發(fā)射出明亮的綠色熒光，它的表達(dá)沒有種屬特異性，不需要輔助因子、底物或其他基因表達(dá)產(chǎn)物的協(xié)助，靈敏度高。在多數(shù)細(xì)胞GFP發(fā)出的熒光可以均勻地充滿胞漿、細(xì)胞核和諸如軸突的遠(yuǎn)端突起。GFP在活細(xì)胞、組織或器官中無需任何處理即可在熒光顯微鏡下直接觀察

7、，加之動(dòng)物體內(nèi)不產(chǎn)生內(nèi)源性GFP，它是活細(xì)胞的理想標(biāo)記物，可以在熒光顯微鏡下直接對(duì)活體細(xì)胞進(jìn)行研究。由于其熒光穩(wěn)定、檢測(cè)方便、對(duì)活細(xì)胞無傷害等，已被作為報(bào)告蛋白在檢測(cè)目的基因表達(dá)、研究細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝及追蹤細(xì)胞系的分化等方面被廣泛應(yīng)用。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhancedgreenfluorescenceprotein，EGFP)是GFP的突變體，是由GFP的第64、65位的苯丙氨酸和絲氨酸分別置換成亮氨酸和蘇氨酸而形成[23]，EGFP

8、在480nm波長的激發(fā)下可以發(fā)射出比GFP亮35倍的綠色熒光，使得其觀察和檢測(cè)更為方便靈敏。 p27基因是Polyak等于1994年發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展和治療方面的作用正不斷被發(fā)現(xiàn)。正常情況下p27基因在G0/G1期表達(dá)增高，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入s期表達(dá)下降。p27基因編碼的P27蛋白是細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制因子(CKIs)，是細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控因子，能作用于整個(gè)細(xì)胞周期，廣泛抑制各種細(xì)胞周期素和CDK的活性，具有負(fù)調(diào)控細(xì)

9、胞周期進(jìn)程、參與細(xì)胞分化的調(diào)控、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用。除此之外P27還可調(diào)節(jié)實(shí)體瘤的耐藥性，防止炎癥對(duì)機(jī)體的損傷。P27被廣泛應(yīng)用于各種腫瘤如消化道腫瘤、乳腺癌、肺癌、宮頸癌等治療的試驗(yàn)研究，P27的降解主要由泛素介導(dǎo)的187位蘇氨酸磷酸化引起，半衰期較短(約2h)，在體內(nèi)不穩(wěn)定，因此p27kip1被稱為“短壽蛋白”。 第一部分：TAT-EGFP融合蛋白對(duì)小鼠生物膜穿透性的研究 人工合成編碼HIV-TATPTD11個(gè)氨基酸

10、的雙鏈寡核苷酸片段，PCR擴(kuò)增目的基因EGFP，分子克隆常規(guī)操作構(gòu)建pET28a-TAT-EGFP重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主菌BL21后用IPTG誘導(dǎo)TAT-EGFP融合蛋白表達(dá)，經(jīng)鎳金屬鰲合層析柱純化獲得融合蛋白。通過腹腔注射到小鼠體內(nèi)，觀察TAT-EGFP融合蛋白穿透各組織生物膜及達(dá)到各組織的時(shí)間、濃度。研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射TAT-EGFP，30min后各主要臟器經(jīng)檢測(cè)均有熒光出現(xiàn)，4h各組織熒光強(qiáng)度達(dá)最大值。研究證明HIV-1TAT-P

11、TD與EGFP形成的融合蛋白可穿透包括腦組織在內(nèi)的所有生物膜。 第二部分PEP-1-EGFP穿透性研究 人工合成編碼PEP-121個(gè)氨基酸的兩條寡核苷酸片段，PCR擴(kuò)增目的基因EGFP，利用T/A克隆，構(gòu)建pGEM-T-EGFP重組質(zhì)粒，分子克隆常規(guī)操作構(gòu)建pET15b-pep-1-EGFP重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主菌E.coliBL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)PEP-1-EGFP融合蛋白表達(dá)，經(jīng)鎳金屬鰲合層析柱純化獲得融

12、合蛋白。在體外培養(yǎng)細(xì)胞及小鼠體內(nèi)研究融合蛋白的穿透性。實(shí)驗(yàn)證明pGEM-TEasy載體的使用使基因克隆過程更加簡便容易，構(gòu)建更加準(zhǔn)確無誤。EGFP的N端加上PEP-1這一人工合成的CPPs形成的融合蛋白，可以無需經(jīng)過復(fù)雜的變性復(fù)性過程，直接以天然有活性的形式穿透體外培養(yǎng)細(xì)胞及小鼠各組織器官。這一研究為使用更加安全有效的穿膜肽奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為使用天然構(gòu)像的EGFP研究活細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能提供了一個(gè)良好的報(bào)告蛋白。 第三部分：P

13、EP-1-P27mt的穿透性研究 人工合成編碼細(xì)胞穿膜肽PEP-121個(gè)氨基酸的雙鏈寡核苷酸片段，構(gòu)建pET15b-pep-1-p27mt重組表達(dá)子，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21(DE3)pLysS宿主菌，IPTG誘導(dǎo)，高效表達(dá)可溶性PEP-1-P27mt融合蛋白，利用表達(dá)蛋白N端的組氨酸“標(biāo)簽”，Ni2+-金屬鰲合樹脂親和層析柱純化目的蛋白，SDS-PAGE分析和Westernblot鑒定純化目的蛋白。在體外培養(yǎng)的食管癌E

14、C9706細(xì)胞加入不同濃度的PEP-1-P27mt并作用不同時(shí)間，免疫熒光觀察加入PEP-1-P27mt10min培養(yǎng)細(xì)胞即出現(xiàn)熒光染色，2h染色光密度達(dá)到最高峰，PEP-1-P27mt終濃度為1nmol/L促細(xì)胞凋亡作用最強(qiáng)。SD大鼠腹腔注射PEP-1-P27mt后，免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)30min各主要臟器均有熒光出現(xiàn)，4h各組織熒光強(qiáng)度達(dá)最大值。 第一部分：TAT-EGFP融合蛋白對(duì)小鼠生物膜穿透性的研究 目的探討TAT

15、-EGFP融合蛋白穿透生物膜的效應(yīng)，為臨床上應(yīng)用生物大分子藥物進(jìn)入組織細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮治療作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。結(jié)論在生物大分子的N-末端加上TAT具有穿透力的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)肽段形成的融合蛋白可有效穿透細(xì)胞膜到達(dá)各組織。 第二部分PEP-1-EGFP穿透性研究 人工合成編碼PEP-121個(gè)氨基酸的兩條寡核苷酸片段，PCR擴(kuò)增目的基因EGFP，利用T/A克隆，構(gòu)建pGEM-T-EGFP重組質(zhì)粒，分子克隆常規(guī)操作構(gòu)建pET15b-pep-

16、1-EGFP重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主菌E.coliBL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)PEP-1-EGFP融合蛋白表達(dá)，經(jīng)鎳金屬鰲合層析柱純化獲得融合蛋白。在體外培養(yǎng)細(xì)胞及小鼠體內(nèi)研究PEP-1-EGFP融合蛋白的穿透性。 第三部分PEP-1-P27mt的穿透性研究 人工合成編碼細(xì)胞穿膜肽PEP-121個(gè)氨基酸的雙鏈寡核苷酸鏈，構(gòu)建pET15b-pep-1-p27mt重組表達(dá)子，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21(DE3)pL

17、ysS宿主菌，IPTG誘導(dǎo)，高效表達(dá)可溶性PEP-1-P27mt融合蛋白，利用表達(dá)蛋白N端的組氨酸“標(biāo)簽”，Ni2+-金屬鰲合樹脂親和層析柱純化目的蛋白，SDS-PAGE分析和Westernblot鑒定純化目的蛋白。在體外培養(yǎng)的食管癌EC9706細(xì)胞加入不同濃度的PEP-1-P27mt并作用不同時(shí)間，免疫熒光觀察加入PEP-1-P27mt10min培養(yǎng)細(xì)胞即出現(xiàn)熒光染色，2h染色光密度達(dá)到最高峰，PEP-1-P27mt終濃度為1mmol

18、/L促細(xì)胞凋亡作用最強(qiáng)。SD大鼠腹腔注射PEP-1-P27mt后，免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)30min各主要臟器均有熒光出現(xiàn)，4h各組織熒光強(qiáng)度達(dá)最大值。實(shí)驗(yàn)證明PEP-1能有效攜帶P27mt進(jìn)入培養(yǎng)細(xì)胞，為應(yīng)用細(xì)胞周期抑制蛋白誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡提供了一種新的生物學(xué)方法。 經(jīng)過對(duì)天然存在的細(xì)胞穿膜肽的生物化學(xué)性質(zhì)研究，已經(jīng)逐漸掌握了細(xì)胞穿膜肽的一些共有特性，這類物質(zhì)均為帶有正電荷的長短不等的多肽片段，其中富含精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸殘基，