纖毛蟲eRF1終止密碼子識別特異性的功能結(jié)構(gòu)域分析.pdf

1、當(dāng)mRNA上的終止密碼子UAA,UAG或者UGA到達(dá)核糖體的A位點(diǎn)時(shí)，被肽鏈釋放因子識別，蛋白質(zhì)翻譯終止。真核生物中，有兩類肽鏈釋放因子參與翻譯終止過程，分別為eRF1和eRF3,但具體的機(jī)制尚不完全確定。大多數(shù)高等真核生物eRF1能識別三個(gè)終止密碼子,而纖毛蟲 eRF1卻只能識別三個(gè)終止密碼子中的一個(gè)或兩個(gè)，稱為密碼子識別特異性eRF1。研究顯示第一類肽鏈釋放因子的N結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)終止密碼子的識別，其包含3個(gè)高度保守的模體結(jié)構(gòu)域：GT區(qū)，

2、TASNIKS區(qū)和YCF區(qū)，對eRF1識別終止密碼子的活性有較大影響。纖毛蟲eRF1識別終止密碼子的特異性是否受到N端三個(gè)保守模體或其中關(guān)鍵氨基酸的調(diào)控，以及三個(gè)模體結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系是值得探討的問題，結(jié)果有助于進(jìn)一步闡明肽鏈釋放因子識別終止密碼子的分子機(jī)制。
　　本實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建了嗜熱四膜蟲（Tetrahymena） eRF1 N端結(jié)構(gòu)域與酵母的M、C端結(jié)構(gòu)域組成的嵌合體eRF1（Tt/Sc eRF1）。利用雙熒光素酶報(bào)告體系，在eR

3、F1基因敲除的酵母細(xì)胞株中測定嵌合體Tt/Sc eRF1識別終止密碼子的性質(zhì)和活性，結(jié)果顯示，Tt/Sc eRF1對終止密碼的識別具有一定的特異性，即對UAA和UAG的通讀效率明顯高于UGA，與四膜蟲eRF1的性質(zhì)一致（對UGA、UAG、UAA的通讀效率分別為2.49％、4.07%、10.12%）。為了分析eRF1中影響終止密碼子識別性質(zhì)的關(guān)鍵模體和氨基酸，我們通過定點(diǎn)突變的方法將嵌合體Tt/Sc eRF1的N結(jié)構(gòu)域中保守模體的一些關(guān)鍵

4、氨基酸，突變?yōu)榻湍竐RF1相應(yīng)的氨基酸。結(jié)果顯示，TASNIKS模體內(nèi)的突變K57T/T59S/D63S使嵌合體eRF1對UGA、UAG通讀效率比野生型分別提高了13.45%、1.84%，對UAA的通讀效率降低了3.48%；YCF模體內(nèi)的突變F125L/S128N使嵌合體eRF1對UGA的通讀效率提高了3.04%，對UAG、UAA通讀的效率分別降低了1.89%、6.72%，說明關(guān)鍵模體內(nèi)氨基酸的改變對四膜蟲 eRF1識別終止密碼子的性質(zhì)

5、產(chǎn)生了不同程度的影響，說明這些氨基酸可能通過影響模體的結(jié)構(gòu)改變了eRF1對密碼子的識別活性。
　　為了分析保守的模體結(jié)構(gòu)或模體間的協(xié)同作用對eRF1性質(zhì)的決定作用。我們進(jìn)一步利用搭橋PCR的方法將原生動(dòng)物藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(Giardia lamblia)和嗜熱四膜蟲eRF1中保守模體及其相鄰區(qū)域的氨基酸分別引入酵母eRF1中，構(gòu)建成由不同模體組合而成的雜合N端嵌合體，以此探究eRF1的N端區(qū)域中關(guān)鍵模體對eRF1識別終止密碼子特異性

6、的影響。構(gòu)建的賈第蟲與酵母 eRF1雜合的 N端嵌合體為Gl(1-84aa)/Sc(76-149aa)-N和 Sc(1-75aa)/Gl(85-157aa)-N；四膜蟲與酵母 eRF1的 N端嵌合體為 Tt(1-77aa)/Sc(76-149aa)-N、Sc(1-75aa)/Tt(78-151aa)-N；Sc(1-38aa)/Tt(41-77aa)/ Sc(76-149aa)-N、Tt(1-40aa)/Sc(39-75aa)/Tt(78

7、-151aa)-N。其中1-40aa包含GTx模體，41-77aa包含TASNIKS模體；78-151aa包含Y-C-F模體。同時(shí)，對N端結(jié)構(gòu)域嵌合體中的一些關(guān)鍵的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行突變，構(gòu)建成N端嵌合體的突變體。將上述N端嵌合體及其突變體基因亞克隆至酵母表達(dá)載體pDB0948中。轉(zhuǎn)化第一類肽鏈釋放因子基因敲除的酵母菌株YDB447、利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和質(zhì)粒洗牌技術(shù)，分析了這些不同的N端結(jié)構(gòu)域嵌合體eRF1識別終止密碼子的性質(zhì)。結(jié)果顯示

8、，Gl/Sc-N對UGA、UAG通讀效率分別提高了12.80%、0.81%，而對UAA的通讀效率降低了3.54%；Sc/Gl-N對UGA、UAG、UAA的通讀效率較野生型分別降低了3.03%、2.92%、5.69%。賈第蟲的eRF1的 N端結(jié)構(gòu)域中引入TASNIKS模體，Sc/Gl-N對于eRF1識別三個(gè)終止密碼子的效率都有所提高，而引入Y-C-F模體， Gl/Sc-N對于終止密碼子中第二位堿基的識別有所影響。引入四膜蟲eRF1的模體，

9、 Tt/Sc-N eRF1對于三個(gè)終止密碼子UGA、UAG和UAA的通讀效率很高，分別達(dá)到了26.39%、8.02%、10.75%，不能識別終止密碼子；Sc/Tt-N eRF1對三個(gè)終止密碼子的通讀效率都相對較低，分別為3.97%、2.09%、3.20%，即能夠同時(shí)識別三個(gè)終止密碼子，由此推測GTx和NIKS模體可能決定eRF1對UAG和UAA的識別。
　　綜上結(jié)果表明，四膜蟲N端結(jié)構(gòu)域中GTx和NIKS模體一定程度決定eRF1識