賈第蟲GeRF1識別終止密碼子性質分析.pdf

1、蛋白質合成是細胞內最重要的生命活動之一，其中包括RNA-RNA，RNA-蛋白質和蛋白質之間的相互作用。這一過程包括核糖體上肽鏈合成的起始、延伸和新生肽鏈的釋放。肽鏈的起始和延伸主要有起始因子和延伸因子的參與，而兩類肽鏈釋放因子(polypeptide release factor，RF)負責終止密碼子的識別和新生肽鏈的釋放。
　　在真核生物中第一類肽鏈釋放因子(eRF1)一級結構的序列有顯著的同源性，由N、M、C三個不同功能結構域

2、組成。結構域N在核糖體A位點識別三個終止密碼子，它含有兩個高度保守的序列TASNIKS和Y(×)C(×××)F。結構域M通常含有GGQ模體，與核糖體上的肽酰轉移酶中心相互作用引起肽酰-tRNA的水解。eRF1的C結構域與eRF3相互作用。eRF3是一種G蛋白，其C端結構域負責與eRF1結合，在核糖體外形成穩(wěn)定的復合體，參與新生肽鏈從核糖體上的釋放，共同完成蛋白質多肽鏈的合成過程。
　　高等真核生物第一類肽鏈釋放因子識別三個通用的終

3、止密碼子，完成新生肽鏈的釋放。在原生動物纖毛蟲中終止密碼子發(fā)生重新分配的現(xiàn)象，如Paramecium、Tetrahymena和Stylonychia將通用終止密碼子UAA和UAG翻譯成谷氨酸酰胺，將UGA識別為終止密碼。Euplotes中UAA和UAG作為終止密碼子，而通用終止密碼子UGA翻譯成半胱氨酸。這種現(xiàn)象提示我們，肽鏈釋放因子識別終止密碼子的活性和性質可能具有一定的進化學特征。
　　藍氏賈第鞭毛蟲（Giardia lamb

4、lia）為鞭毛類單細胞真核生物，是原生動物中最為原始的一個類群。細胞內沒有典型的線粒體結構，認為是在線粒體形成之前產(chǎn)生的物種。其肽鏈釋放因子的結構與進化程度較高的纖毛蟲和高等真核生物相比具有明顯的差異，為我們研究蛋白質合成終止機制的進化提供了理想了模式。
　　本研究以藍氏賈第鞭毛蟲為材料，從基因組擴增得到了其兩類肽鏈釋放因子基因GeRF1和GeRF3。將它們分別連接到酵母表達載體pGADT7和pGBKT7中，共轉化酵母菌株AH10

5、9，涂板培養(yǎng)。利用酵母雙雜交技術證實賈第蟲eRF1和eRF3在體內相互作用，說明在賈第蟲中兩類肽鏈釋放因子通過協(xié)同作用參與蛋白質合成的終止過程。
　　以往的研究表明，第一類肽鏈釋放因子的N端結構域負責終止密碼子的識別，故我們構建了由賈第蟲eRF1的N端結構域與釀酒酵母的M和C端結構域組成的重組基因Gl/Sc eRF1。在第一類肽鏈釋放因子被敲除的酵母菌株YDB447中分析賈第蟲第一類肽鏈釋放因子識別終止密碼子的性質和活性。首先，將

6、構建的Gl/Sc eRF1基因克隆至酵母表達質粒pDB984中，利用5'-FOA驅除含有酵母野生型eRF1基因的質粒，觀察在重組質粒表達的融合蛋白Gl/Sc eRF1作為細胞中唯一肽鏈釋放因子的情況下酵母細胞的活力，分析融合蛋白Gl/Sc eRF1識別終止密碼子的活性和性質。結果顯示，含有該融合蛋白的酵母細胞不能正常的生長，說明Gl/Sc eRF1在酵母細胞中不能識別終止密碼子。
　　進一步用雙熒光素酶通讀報告系統(tǒng)分析融合蛋白Gl

7、/Sc eRF1分別對三個終止密碼子的識別活性。證實融合的Gl/Sc eRF1不能識別三個終止密碼子。對GeRF1的N端結構域中關鍵的氨基酸進行突變(T26L，G48K，N112E T113N，S134N)，使其與酵母相應位點的氨基酸一致。結果表明盡管突變體Gl/Sc eRF1識別三個終止密碼子的活性發(fā)生了一些變化，但是與野生型相比，其識別活性不足以維持細胞的正常生存。
　　盡管其他高等真核生物的第一類肽鏈釋放因子的N端負責識別三