纖維素外切葡聚糖酶CBH I在Pichia pastoris中的表達(dá)研究.pdf

1、山東大學(xué)碩士學(xué)位論文纖維素外切葡聚糖酶CBH I在Pichia pastoris中的表達(dá)研究姓名：姚博申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：曲音波20040525——一 些至奎堂堡主竺焦堡塞A B S T R A C TT h e m e t h y l o t r o p h i cy e a s tP i c h i ap a s t o r i sh e t e r o l o g o u sg e n ee x p r e

2、s s i o ns y s t e mh a s b e e n u t i l i z e d t o p r o d u c e a t t r a c t i v e l e v e l s o f av a r i e t y o f i n t r a c e l l u l a x a n de x t r a c e l l u l a r p r o c e i n so f i n t e r e s t ．I th

3、 a sa l o to f a d v a n t a g e s a se x p r e s s i o n h o s t sf o rt h ee x i s t e n c e o f w e l l - e s t a b l i s h e d f e r m e n t a t i o n m e t h o d s a n d t h e p r e s e n c e o fm e t h n o l —r e g

4、 u l a t e dp r o m o t e r s ．I tn o to n l yh a sw i d ec o m m e r c i a la p p l i c a t i o n ，b u ta l s oh a s p o t e n t i a ls i g n f i c a n c e i nt h e o r y ．T h i s a r t i c l ec o n s t r t ／e t sa r e

5、c o m b i n a n t p l a s m i dp P I C 9 k —c b h I a n d t r a n s f o r m i ti n t om e t h y l o t r o p h i c y e a s t ( P i c h i a p a s t o r i s ) f o r e x p r e s s i n g C B H Ip r o t e i n ．T h e c b h 1D N

6、 A f r a g m e n t w i t hS n a B Ia n dA v r I Ia t5 ’a n d3 ’t e r m i n iw a s p r e p a r e db y P C R u s i n g p l a s m i d p U C m T - c b h l a St e m p l a t e a n d a p a i ro f d e s i g n e d p r i m e r s w

7、 h i c hc a r r i e dS n a B Ii nu p s t r e a ma n d A v r I Ii nd o w n s t r e a m ．A f t e rd i g e s t e db y b o t hS n a BIa n dA v r I I ，c b h lD N A f r a g m e n tw a sl i n k e dw i t hp l a s m i d p P I C 9

8、 k ．T h ep P I C 9 k —c b h lw a st r a n s f o r m e di n t oc o m p e t e n tJ M l 0 9 ．P o s i t i v ec l o n e sw e r es c r e e n e d ．T h ep l a s m i dp P I C 9 k —c b h 1 i s o l a t e da n d p u r i f i e df r o

9、 mp o s i t i v ec l o n e sW a sc o m f i r m e d b yd i g e s t i n gw i t l l b o t hS n a BI a n dA v r Ⅱ．T h er e s u l t ss h O W e dt } 1 a t e b h lD N A w a sl i n k e dw i t hp l a s m i d p P I C 9 k s u c c e

10、 s s f u l l y ．T h ep l a s m i d w a s t r a n s f o r m e d i n t oe l e c t r o p o r a t e dP i c h i ap a s t o r i sa n d s c r e e n e d t h ep o s i t i v es t r a i n so n M D p l a t e sw i t h o u t h i s t i

11、 d i n e ．C o n c e m i n gt h ee x p r e s s i n g p r o c e s s ，w e f o r m u l a t e d a l l i m p r o v e dc o n d i t i o n t Oi n c r e a s e e x p r e s s i o n o f t h e t a r g e t g e n e ．W e f o u n d t h a

12、t t h e e x p r e s s i o n w a sm u c hi m p r o v e d i nt h em e t h y l e n i c c o n c e n t r a t i o n o f 0 ．5 ％a f t e r3d a y s ．T h ee x p r e s s e d p r o t e i nh a sb e e n e v a l u a t e db y S D S —P A

13、G E ．A l l t h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e p l a s m i dp P I C 9 k —c b h l w a sc o n s t r u c t e d a n de x p r e s s e di nt h e y e a s t P i c h i a p a s t o r i s s u c c e s s f u l l y ．F u r t

14、h e r m o r et h i sa r t i c l et r i e st os t u d yr e b u i l d i n gg l y c o s y l a t e ds i t eo fC B H Ib yS i t e —d i r e c t e d m u t a t i o n ．a(chǎn) n d t O d e m o n s t r a t et h ee x p r e s s i o ni n f l