熱纖梭菌纖維素內(nèi)切葡聚糖酶在釀酒酵母細(xì)胞表面上的展示及其性質(zhì)研究.pdf

1、纖維素是一種可再生資源,且是地球上數(shù)量最大的。但是由于纖維素具有木質(zhì)素外被以及水不溶性的高結(jié)晶結(jié)構(gòu),所以纖維素被水解為可利用的小分子葡萄糖是相當(dāng)困難的。這也就導(dǎo)致了纖維素的利用率極低。而纖維素酶是能夠?qū)⒗w維素水解為葡萄糖的一組酶的總稱,包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。但是纖維素酶的生產(chǎn)成本高且活性很低,這兩個(gè)限制纖維素應(yīng)用的瓶頸問題成為纖維素研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展,采用不同的表達(dá)載體進(jìn)行重組蛋白的表達(dá),

2、使得這一難題得到緩解。
　　對本實(shí)驗(yàn)室保存的一株產(chǎn)纖維素內(nèi)切葡聚糖酶的厭氧熱纖梭菌進(jìn)行研究,首先提取基因組總 DNA,根據(jù)熱纖梭菌纖維素內(nèi)切葡聚糖酶基因序列和釀酒酵母細(xì)胞表面展示質(zhì)粒載體 pYD1上的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,連接到載體并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌宿主細(xì)胞,篩選后進(jìn)行序列測定及比對。然后將該基因連接到表面展示質(zhì)粒載體 pYD1上,并轉(zhuǎn)化用于表面展示釀酒酵母 EBY100菌株中,挑選陽性轉(zhuǎn)化子,經(jīng)酵母菌落 PCR證實(shí)

3、纖維素內(nèi)切葡聚糖酶基因已成功整合到酵母基因組中。接著,用2％的半乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),后用剛果紅平板法對誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果進(jìn)行初步鑒定,重組酶點(diǎn)種后平板出現(xiàn)透明圈。最后用DNS法測其表面展示酶的酶活及其性質(zhì)研究。
　　通過對表面展示的纖維素內(nèi)切葡聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)研究,發(fā)現(xiàn)此酶的最適反應(yīng)溫度是50℃,同時(shí)在 pH4.6時(shí)該表達(dá)產(chǎn)物具有較高的酶活;最適反應(yīng)時(shí)間為10min,用2％的半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)60h后酶活達(dá)到最高,為32IU/ml,較天然酶