熱纖梭菌β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因celD在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)是一種厭氧嗜熱菌，其產(chǎn)生的β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶具有耐熱特性。本研究克隆了熱纖梭菌β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因celD采用大腸桿菌BL21和畢赤酵母GS115對其進(jìn)行表達(dá)，并對表達(dá)產(chǎn)物的活性和酶學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)性分析。主要研究結(jié)果如下： 以提取的熱纖梭菌基因組為模板，利用TD-PCR技術(shù)克隆了熱纖梭菌β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因celD，并構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEM-T

2、Easy TCE Vector。測序表明，其長度為2058 bp，ORF為1947 bp，編碼649個氨基酸，5，端有一個編碼41個氨基酸的信號肽序列，其全長理論分子量為72.4 kDa。 通過帶限制性內(nèi)切酶位點的引物(5TCE帶EcoR I位點，3TCE帶Not I位點)，將熱纖梭菌β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因celD定向插入到原核表達(dá)載體pET-30a(+)上，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)TCEVector。在大腸桿

3、菌BL21(DE3)中得以表達(dá)，SDS-PAGE凝膠電泳顯示在77 kDa左右處有一特異的融合蛋白條帶。單位發(fā)酵液的酶活力為22U/ml。 根據(jù)酵母表達(dá)載體pPIC9K的多克隆位點和已克隆的β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因celD限制性內(nèi)切酶圖譜，將熱纖梭菌β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因celD以N-端融合的方式正確插入到酵母表達(dá)載體pPIC9K上的α-因子信號肽編碼序列的3，端，構(gòu)成重組表達(dá)載體.pPIC9K-TCE。用電擊法將經(jīng)B

4、gl Ⅱ單酶切線性化的pPIC9K-TCE轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115菌株，從而整合到酵母染色體DNA中得到重組轉(zhuǎn)化子。篩選到的基因工程菌經(jīng)培養(yǎng)后，上清液的發(fā)酵活力為8 U/ml， SDS-PAGE凝膠電泳檢測，表達(dá)的β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶的分子量約為72 kDa，這表明β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因celD在畢赤酵母得到了表達(dá)。 對兩種表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)的β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶生物學(xué)特性研究顯示，Ecoli TCE菌株與Pichia