果蠅Aurora B抑制模型的建立和在體（in vivo）功能分析.pdf

1、近幾年在對細胞有絲分裂過程的研究中發(fā)現(xiàn)，存在著一個動點蛋白的調控網絡。其中有一類蛋白家族—染色體乘客蛋白(AuroraB，INCENP，survivin，TD-60)在細胞有絲分裂過程中扮演著重要的角色，是與染色體有效而又忠實的分離以及胞質分裂密切相關的。研究表明，AuroraB是該乘客蛋白家族中唯一的一個具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的蛋白，目前已證實可與INCENP以及Survivin組成復合物來調控自身的活性，并通過磷酸化下游底物來調

2、控有絲分裂的進程。 為了能夠進一步在體研究AuroraB基因的功能，了解其在果蠅發(fā)育中的作用，首先通過基因重組技術，在體外融合表達純化AuroraB-(His)6蛋白，免疫動物后經GST-AuroraB-N截短蛋白的純化獲得抗AuroraB的多克隆抗體，經免疫印跡法鑒定結果顯示，該抗體在原核表達體系及果蠅組織中均可檢測到目的蛋白，并有較好的特異性和反應性。 運用轉基因技術，我們選用了果蠅Pelement改建的載體pW

3、IZ，構建了重組質粒pWIZ-AuroraB-dsRNA，通過顯微注射的方法，獲得用于AuroraB抑制表達的轉基因果蠅?；贕AL4-UAS系統(tǒng)，選擇不同的GAL4-品系果蠅與我們的轉基因果蠅進行雜交。結果顯示，在da-GAL4或Actin-GAL4驅動抑制AuroraB表達時，會導致90％以上的果蠅蛹期致死，當轉基因果蠅pWIZ-AuroraB-dsRNA與eyeless-GAL4雜交后，可以驅動AuroraB在果蠅眼睛成蟲盤MF前

4、的細胞內沉默，結果顯示50％的果蠅會致死，還有50％的果蠅大部分表現(xiàn)為復眼的缺陷表型，通過掃描電鏡和果蠅復眼切片的H.E染色進一步表明，在果蠅眼睛成蟲盤干涉AuroraB后由于細胞分裂的異常，導致ommatidia數目的減少以及排列規(guī)律的打破。在Vg-GAL4的驅動下抑制AuroraB在翅膀成蟲盤細胞內的表達，會引起果蠅翅膀發(fā)育的異常，并且翅膀發(fā)育缺陷同復眼缺陷表型一樣常表現(xiàn)出不對稱性。根據上述實驗結果提示，果蠅AuroraB激酶對果蠅