小麥TaPPR4基因的克隆及其功能研究.pdf

1、PPR(pentatricopeptide repeats)基因組成陸生植物中最大的基因家族。真核生物的PPR基序由35個簡并氨基酸序列串聯(lián)陣列形成，并且通過序列特異的結(jié)合發(fā)揮修飾DNA或RNA的功能，大多數(shù)高等植物PPR基因定位在葉綠體和線粒體中，其功能主要是調(diào)節(jié)植物的葉綠體和線粒體基因的表達。有些PPR蛋白的C-末端存在額外的結(jié)構(gòu)域，最普遍的就是E和DYW結(jié)構(gòu)域，也包括一些DNA或RNA鏈接結(jié)構(gòu)域，如Small MutS-relat

2、ed(SMR)結(jié)構(gòu)域。盡管成員很少，然而它們具有非常重要的生理功能，可是潛在的調(diào)節(jié)機制還不清楚。本研究克隆了一個小麥TaPPR4基因，該基因編碼蛋白擁有2個PPR和1個SMR結(jié)構(gòu)域。通過生化與遺傳學(xué)的方法研究了TaPPR4基因?qū)χ参锷L發(fā)育的影響，分析了該基因在小麥蔗糖信號傳遞過程中的作用。主要研究結(jié)果如下:
　　1.系統(tǒng)進化分析表明TaPPR4的同源基因可以在苔蘚(Physcomitrella patens)中找到，說明TaPP

3、R4的同源基因出現(xiàn)在PPR蛋白家族早期的進化過程中。然而多重序列比對分析表明TaPPR4的同源基因僅僅在單子葉植物中是非常保守的。
　　2.構(gòu)建了亞細胞定位載體p16318-TaPPR4-GFP和p16318-pTAC2-mCherry，利用PEG介導(dǎo)的方法共同轉(zhuǎn)化小麥原生質(zhì)體，結(jié)果表明TaPPR4蛋白定位在葉綠體上，且GFP與mCherry信號能夠完美疊加，說明TaPPR4與pTAC2可能擁有相似的功能。
　　3.通過qR

4、T-PCR，TaPPR4基因啟動子GUS染色和mRNA原位雜交的方法研究TaPPR4基因組織特異性表達，結(jié)果表明TaPPR4基因在植物生長發(fā)育不同時期的不同組織中均廣泛的表達。
　　4.構(gòu)建了TaPPR4基因過表達（TaPPR4-OX）和RNAi干擾(RNAi)植物表達載體，并通過基因槍轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化小麥愈傷組織得到TaPPR4-OX和RNAi株系。與野生型相比，RNAi株系沒有明顯的表型差異，但是TaPPR4-OX小麥株系生長發(fā)

5、育提前，同時TaPPR4-OX株系的根長縮短，株高變高，分蘗數(shù)降低，穗長變長，穗粒數(shù)降低，種子也不飽滿。
　　5.通過qRT-PCR的方法檢測了野生型、RNAi和TaPPR4-OX植株中葉綠體編碼基因的表達情況。結(jié)果顯示TaPPR4基因干擾和過表達影響小麥葉綠體基因atpE的表達。
　　6.利用酵母雙雜交的原理，以TaPPR4蛋白為誘餌篩選小麥cDNA文庫，找到TaPPR4可能的互作蛋白TaSnRK1。通過酵母雙雜交、BIF