水稻葉形控制基因的克隆及其功能研究.pdf

1、水稻是世界上最重要的糧食作物之一,葉片形態(tài)研究一直備受關(guān)注.葉片是植物體進行光合作用的最基本營養(yǎng)器官,大部分葉片形態(tài)改變都會影響到植物體的光合作用、蒸騰作用和抗逆性等生理功能,從而極大的影響到植株的生長和發(fā)育. 本文為了研究水稻葉形態(tài)建成的控制機制和植物葉片結(jié)構(gòu)組成的分子機理,從EMS化學(xué)誘變粳稻日本晴種子的M2代中分離了兩個水稻葉片極度卷曲的突變體H77、H28，并從<'60>Co γ-射線誘變的秈稻品種雙科早處理的M<,2>代中獲得

2、的2份卷葉突變體材料K27和K92.文中對這些卷葉突變體進行了等位性檢測、葉片細胞形態(tài)學(xué)切片觀察,突變性狀遺傳分析,卷葉控制基因的圖位克隆及功能初步研究。 一、水稻卷葉突變體sll1的鑒定、遺傳分析及基因精細定位。 1.水稻卷葉突變體sll1的鑒定、遺傳分析及基因精細定位1、等位性檢測:對4份卷葉突變體進行正反交,并對F1植株進行表型鑒定.結(jié)果表明1177和H28兩個卷葉突變體等位.暫時把這些卷葉突變類型稱統(tǒng)為蔥卷突

3、變(shallot like leaf,sll),分別命名為 sll1-1 和 sll1-2. 2.從葉片細胞形態(tài)學(xué)切片觀察和生理生化測定結(jié)果顯示,SLL1基因的突變造成葉片維管束遠軸面厚壁細胞的缺失,葉片葉綠素含量增加和纖維素含量的下降. 3.遺傳分析:sll1-1與3個正常平展葉秈稻品種NJ6、廣四和粳稻品種日本晴作父本分別進行正反交,并對所有的雜交組合的F<,1>、F<,2>代的植株葉片表型進行分析.結(jié)果表明,

4、在所有組合的F<,1>的全部植株均為正常平展葉,F<,2>代分離群體中的葉片正常株與突變株的分離比符合3∶1.由此我們認(rèn)為 sll1-1 的突變體的表型受隱性單基因控制. 4.利用卷葉性狀能穩(wěn)定遺傳的 sll1-1突變體 (粳稻) 與秈稻品種南京6號(NJ6)雜交構(gòu)建定位群體,運用SSR和STS標(biāo)記,最終將SLL1基因精細定位在第9染色體長臂上物理距離為29.57Kb的區(qū)間內(nèi),共包含3個開放閱讀框,預(yù)測分別編碼一個合成蛋白、類

5、似En/Spm轉(zhuǎn)座子和MYB蛋白. 二、水稻卷葉控制基因SSL1的克隆和初步功能研究。 1.測序結(jié)果表明突變體sll1-1、sll1-2基因組序列都發(fā)生了單堿基的替換(G到A).根據(jù)cDNA水平檢測發(fā)現(xiàn) sll1-1、sll1-2 的突變事件分別發(fā)生在同一基因內(nèi)部兩個不同的剪接位點上,導(dǎo)致mRNA不能正常剪接. 2.明確 SLL1基因位于BAC克隆B1040D06的103061-108515的位置,其gDN

6、A長度為5455bp,cDNA全長為1134bp,共編碼377個氨基酸.共包含6個外顯子(Exon)和5個內(nèi)含子(Intron). 3.從RT-PCR的結(jié)果表明,SLL1基因在整個植株個器官中都有不同程度的表達.其中,葉、花和穎殼中的表達量最高,其次是根、最弱的是莖稈和葉鞘部分.4、我們通過構(gòu)建植物表達載體SLL1::GUS轉(zhuǎn)化水稻,在SLL1::GUS轉(zhuǎn)基因植株的整個生長發(fā)育階段,所有部位都能檢測到GUS活性,但在各組織器官

7、表達范圍存在一定差異.在葉片泡狀細胞中沒有表達,而在維管束、氣孔、導(dǎo)管等疏導(dǎo)組織中都有較強表達.在種子幼芽、葉片(包括葉鞘)、莖稈和種子穎殼中表達范圍較廣,主要在脈絡(luò)系統(tǒng)中有較強的表達;而在根中只有中柱鞘、籽粒中只用疏導(dǎo)組織和花中只有雄蕊能檢測到藍色.5、通過互補試驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入SLL1基因的卷葉突變體slll,葉片表型恢復(fù)正常. 三、水稻卷葉突變體alm的遺傳分析及基因精細定位。 1.等位性檢測結(jié)果表明,卷葉突變

8、體K27與K92等位.由于其卷曲程度沒有slll嚴(yán)重,為區(qū)別起見,我們將K92、K27突變體(adaxialized leaf mutant)分別命名為alm-1和alm-2. 2.從葉片細胞形態(tài)學(xué)切片觀察發(fā)現(xiàn),ALM1基因功能的喪失造成了維管束兩側(cè)、靠近葉片近軸面的泡狀薄壁細胞的增加,其維管束細胞結(jié)構(gòu)正常. 3.alm-1經(jīng)過連續(xù)多代自交種植,確認(rèn)突變性狀能穩(wěn)定遺傳.對aim-1/NPB、aim-1/TNl2個組合