漆酶在斑玉蕈菌絲生長和子實(shí)體發(fā)育中的功能研究.pdf

1、斑玉蕈（Hypsizigus marmoreus）又名真姬菇、蟹味菇，是一種食藥用菌，其味道鮮美，肉質(zhì)細(xì)嫩，口味甚佳，在日本有“香在松茸，味在玉蕈”之說，在國內(nèi)也得到消費(fèi)者的青睞。斑玉蕈是異宗配合的四極性擔(dān)子菌，從接種到商品子實(shí)體采收的生產(chǎn)周期105天左右，比金針菇和杏鮑菇分別長60天和45天，因而工業(yè)化生產(chǎn)的效率相對(duì)較低。斑玉蕈長栽培周期主要?dú)w因于其獨(dú)特的生理特點(diǎn)，即從菌絲生長向子實(shí)體生長轉(zhuǎn)化前必須經(jīng)過一個(gè)45天的菌絲體的后熟階段，目

2、前后熟階段確切的生理作用尚不明確。另外，由于缺乏遺傳操作手段和基因組學(xué)的研究背景，斑玉蕈的分子生物學(xué)研究進(jìn)展緩慢。因此，本研究首先通過轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對(duì)斑玉蕈不同發(fā)育時(shí)期的的差異表達(dá)基因進(jìn)行了分析，確定漆酶基因家族作為后續(xù)研究對(duì)象;然后，通過外源添加漆酶抑制劑曲酸從生理水平上研究了漆酶在斑玉蕈子實(shí)體發(fā)育中的功能;再次，在斑玉蕈中構(gòu)建了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的傳轉(zhuǎn)化體系;最后，利用構(gòu)建的遺傳轉(zhuǎn)化體系，從分子水平上研究了漆酶基因家族在斑玉蕈子實(shí)體發(fā)育中的功能

3、，以期縮短斑玉蕈的發(fā)育周期。主要結(jié)果為以下幾個(gè)方面:
　　1.轉(zhuǎn)錄組技術(shù)篩選和子實(shí)體發(fā)育相關(guān)的差異表達(dá)基因:為了篩選和斑玉蕈子實(shí)體發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵基因，本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對(duì)斑玉蕈的菌絲扭結(jié)期、轉(zhuǎn)色期、原基期和子實(shí)體期四個(gè)發(fā)育時(shí)期進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序。轉(zhuǎn)錄組測序后，通過兩兩樣本進(jìn)行比較，篩選出樣本之間的差異表達(dá)基因，并對(duì)這些差異表達(dá)基因在斑玉蕈子實(shí)體發(fā)育中可能的功能進(jìn)行了分析。研究發(fā)現(xiàn)斑玉蕈有14種漆酶同工酶基因，并命名為lcc1到

4、lcc14。這14種漆酶基因在斑玉蕈的四個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式差異很大，預(yù)測它們?cè)诎哂褶ψ訉?shí)體發(fā)育中發(fā)揮著重要的功能。我們將漆酶基因家族在斑玉蕈子實(shí)體發(fā)育中的功能作為后續(xù)的研究對(duì)象。
　　2.漆酶在斑玉蕈子實(shí)體發(fā)育中的功能:為了研究漆酶在斑玉蕈子實(shí)體發(fā)育中的功能，本研究首先選擇了漆酶的專一性抑制劑曲酸，通過外源添加曲酸的方式，初步從生理上考察了漆酶與斑玉蕈菌絲生長和子實(shí)體發(fā)育的關(guān)系。外源添加漆酶抑制劑可以顯著地抑制斑玉蕈漆酶活性

5、和菌絲生長，說明漆酶在斑玉蕈的營養(yǎng)生長階段與菌絲生長存在相關(guān)性。另外，外源添加曲酸在培養(yǎng)料中不僅可以誘導(dǎo)斑玉蕈原基提前發(fā)生，同時(shí)可以促使斑玉蕈子實(shí)體提前成熟。當(dāng)菌絲培養(yǎng)時(shí)間是60天和85天和添加曲酸的濃度是10 mM時(shí)，60天的子實(shí)體單瓶產(chǎn)量與85天的相當(dāng)。由這個(gè)結(jié)果可以說明外源添加漆酶抑制劑可以有效地縮短斑玉蕈菌絲培養(yǎng)時(shí)間25天。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)添加曲酸后漆酶活性呈現(xiàn)先降低后提高的趨勢，即在菌絲恢復(fù)期被抑制和在菌絲轉(zhuǎn)色期和原基期被提高，

6、可能是因?yàn)橥庠刺砑忧崾沟闷崦富蚣易宕蟛糠殖蓡T的轉(zhuǎn)錄水平在菌絲恢復(fù)期被下調(diào)和在轉(zhuǎn)色期和原基期被上調(diào)。由以上結(jié)果可以得出上調(diào)漆酶基因家族轉(zhuǎn)錄水平可以提高漆酶活性，進(jìn)而可以促進(jìn)菌絲生長、原基發(fā)生、子實(shí)體成熟和縮短斑玉蕈菌絲培養(yǎng)時(shí)間。
　　3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的斑玉蕈遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立:為了更深入地研究漆酶基因在斑玉蕈子實(shí)體發(fā)育中的功能，本研究首次在斑玉蕈中建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，并在這一體系的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了漆酶基因的過量表達(dá)。首

7、先通過根癌農(nóng)桿菌LBA4404菌株和斑玉蕈原生質(zhì)體細(xì)胞的共培養(yǎng)以及潮霉素B的抗性篩選，獲得了一批具有潮霉素抗性的斑玉蕈轉(zhuǎn)化子菌株，并通過PCR擴(kuò)增潮霉素基因（hph與斑玉蕈gpd啟動(dòng)子序列的融合片段（gpd-hph和Southern Blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)潮霉素基因片段hph已成功整合進(jìn)斑玉蕈轉(zhuǎn)化子的基因組中。然后通過對(duì)轉(zhuǎn)化中的各參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化以期獲得最大的轉(zhuǎn)化效率。實(shí)驗(yàn)中利用農(nóng)桿菌菌株EHA105，在農(nóng)桿菌與原生質(zhì)體比例為1000∶1，添加乙

8、酰丁香酮濃度為0.25 mM，于26℃共培養(yǎng)24 h的條件下，我們得到約150個(gè)轉(zhuǎn)化子/105原生質(zhì)體的較高轉(zhuǎn)化效率。接下來本研究通過應(yīng)用斑玉蕈的gpd基因啟動(dòng)子、香菇的gpd基因啟動(dòng)子以及靈芝的gpd基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)抗性標(biāo)記基因表達(dá)，從而比較不同來源啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響，研究發(fā)現(xiàn)以斑玉蕈gpd基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)抗性標(biāo)記基因表達(dá)的載體獲得了最高的轉(zhuǎn)化效率，而應(yīng)用香菇和靈芝的gpd基因啟動(dòng)子獲得轉(zhuǎn)化效率都低于斑玉蕈gpd基因的啟動(dòng)子。這一結(jié)果

9、證明了使用內(nèi)源啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)能夠顯著提高轉(zhuǎn)化效率。同時(shí)，該遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立為本課題接下來對(duì)相關(guān)功能基因的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　4.為了進(jìn)一步研究漆酶基因在斑玉蕈子實(shí)體發(fā)育中的功能，本研究利用已經(jīng)構(gòu)建好的斑玉蕈的遺傳轉(zhuǎn)化體系對(duì)漆酶基因lcc1進(jìn)行了過量表達(dá)研究。研究中構(gòu)建了過量表達(dá)載體Hm-Lcc1，并通過應(yīng)用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的斑玉蕈轉(zhuǎn)化方法，將Hm-Lcc1過量表達(dá)載體轉(zhuǎn)入斑玉蕈中。隨機(jī)挑取5株獲得的過表達(dá)轉(zhuǎn)化子OE-Lc

10、c1s，進(jìn)行RT-PCR分析研究發(fā)現(xiàn)OE-Lcc1-1中l(wèi)cc1基因的表達(dá)量約為野生型菌株SIEF3133的3倍;其余三株OE-Lcc1s中l(wèi)cc1基因的表達(dá)量也均在野生型菌株SIEF3133的2倍以上。為了深入地研究過量表達(dá)轉(zhuǎn)化子對(duì)表型的影響，我們分別檢測了它們的胞外漆酶活性和菌絲生物量，發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)轉(zhuǎn)化子的漆酶活性和生物量都有不同程度地提高。對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行結(jié)實(shí)性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)轉(zhuǎn)化子菌絲在培養(yǎng)料中的生長速度明顯快于野生型菌株和原基發(fā)