核因子Nrf2負(fù)向調(diào)節(jié)肺炎支原體LAMPs誘導(dǎo)人THP-1細(xì)胞產(chǎn)生炎癥物質(zhì).pdf

1、[目的]脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白（lipid-associated membrane proteins，LAMPs）是肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，Mp）的主要致炎因子。實驗通過研究核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor2，Nrf2）對Mp LAMPs誘導(dǎo)人單核系THP-1細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子、炎癥蛋白及炎癥介質(zhì)的影響，了解Nrf2對Mp LAMPs所致炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，為進(jìn)

2、一步研究 Mp的致病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。
　　[方法]培養(yǎng)Mp，離心收集菌體沉淀并抽提LAMPs，用BCA法測定LAMPs濃度。構(gòu)建慢病毒載體pLKO.1-Nrf2 shRNA，將其與輔助包裝質(zhì)粒（psPAX2，pMD2G）共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞用以包裝慢病毒，將收獲的慢病毒感染體外培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞，嘌呤霉素篩選陽性感染細(xì)胞后，western blot和qRT-PCR分別檢測慢病毒感染后THP-1細(xì)胞Nrf2的蛋白和mR

3、NA水平。用5μg/mL和10μg/mL Mp LAMPs分別刺激Nrf2 shRNA慢病毒感染的THP-1細(xì)胞和對照慢病毒感染細(xì)胞，并設(shè)立PBS刺激為陰性對照組，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作用為陽性對照組。ELISA檢測處理后各組THP-1細(xì)胞白細(xì)胞介素6（interleukine6，IL-6）、白細(xì)胞介素8（interleukine8，IL-8）與前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）

4、的表達(dá)，Griess法檢測一氧化氮（nitric oxide，NO）的產(chǎn)生水平，western blot檢測環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase2，COX-2）及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的表達(dá)。7.5μg/mL Mp LAMPs分別刺激活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）

5、、血紅素氧合酶-1（heme oxygenase，HO-1）特異性激動劑鈷原卟啉（cobalt protoporphyrin，CoPP）或HO-1特異性抑制劑鋅原卟啉（zinc protoporphyrin，ZnPP）預(yù)處理的THP-1細(xì)胞，Nrf2 shRNA慢病毒感染細(xì)胞，對照病毒慢感染細(xì)胞及PBS處理的THP-1細(xì)胞，運(yùn)用熒光探針2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2',7'-dichlorofluorescin diacetate，

6、DCFH-DA）檢測ROS的產(chǎn)生水平。
　　[結(jié)果]（1）測序結(jié)果顯示所構(gòu)建的pLKO.1-Nrf2 shRNA慢病毒正確。與對照慢病毒感染及 PBS處理的THP-1細(xì)胞相比，pLKO.1-Nrf2 shRNA慢病毒感染細(xì)胞Nrf2 mRNA表達(dá)水平分別抑制了64.73％與62.98%，而 Nrf2的蛋白表達(dá)量分別抑制了44.43%與40.48%；Mp LAMPs處理后pLKO.1-Nrf2 shRNA慢病毒感染細(xì)胞Nrf2 mR

7、NA表達(dá)水平與蛋白表達(dá)量分別降低了66.12%與52.12%；（2）Mp LAMPs刺激顯著增強(qiáng)了THP-1細(xì)胞中IL-6、IL-8、COX-2、iNOS、PGE2的表達(dá)水平與NO和ROS的產(chǎn)生水平。Mp LAMPs刺激Nrf2 shRNA慢病毒感染的THP-1細(xì)胞后，IL-6、IL-8與 PGE2的表達(dá)水平分別為150.09pg/mL，196.18pg/mL和123.88 pg/mL，較對照慢病毒感染的THP-1細(xì)胞分泌的IL-6、I

8、L-8與PGE2（分別為75.03pg/mL，90.09 pg/mL與66.42pg/mL）顯著增高（p<0.05）；Mp LAMPs刺激后，Nrf2基因沉默組THP-1細(xì)胞表達(dá)的COX-2、iNOS蛋白水平較對照組分別升高了20.37%與26.65%（p<0.05），Nrf2基因沉默組 THP-1細(xì)胞產(chǎn)生的NO與ROS分別較對照組增加了73.17%與19.57（p<0.05）；（3）與無處理細(xì)胞相比較，ROS清除劑NAC預(yù)處理THP-

9、1細(xì)胞后Mp LAMPs刺激細(xì)胞產(chǎn)生的ROS水平降低了8.28%，而Mp LAMPs誘導(dǎo)細(xì)胞HO-1 mRNA的表達(dá)水平升高了12.76倍；與無處理細(xì)胞相比較，HO-1特異性激動劑CoPP處理組Mp LAMPs刺激細(xì)胞產(chǎn)生的ROS水平降低了7.64%，而 HO-1特異性抑制劑 ZnPP處理組 Mp LAMPs刺激細(xì)胞產(chǎn)生的ROS的水平升高了15.28%。
　　[結(jié)論]Nrf2能夠負(fù)向調(diào)節(jié)Mp LAMPs誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)IL-