小鼠PD-1、CD152、FOXP3、LAG-3啟動(dòng)子的克隆和鑒定及其介導(dǎo)的多色熒光蛋白載體的構(gòu)建.pdf

1、免疫耐受的形成是多種病毒感染慢性化的最主要機(jī)制。最新的研究顯示調(diào)節(jié)性DCs和Tregs細(xì)胞及其特征分子PD-1、CTAL-4、FOXP3和LAG-3在感染免疫耐受形成中發(fā)揮著重要的作用,但是對于上述分子對調(diào)節(jié)性DCs和Tregs功能發(fā)揮的相關(guān)性如何則不甚清楚。因此弄清上述分子在不同感染和免疫耐受狀況下的時(shí)序表達(dá)對于深入了解病毒特異免疫耐受形成的細(xì)胞和分子機(jī)制及對于尋找更好的抗乙肝病毒策略并最終攻克該疾病具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。
　　

2、 本論文分為兩部分,在第一部分,我們研究了小鼠PD-1基因啟動(dòng)子的活性并初步探討了PD-1分子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。利用藻紅素標(biāo)記的抗小鼠PD-1單克隆抗體流式檢測佛波酯(PMA)和離子霉素(IO)刺激前后小鼠T淋巴瘤細(xì)胞EL4和骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0-Ag表面PD-1蛋白的表達(dá)水平,FACS結(jié)果顯示EL4細(xì)胞無藥物刺激時(shí)組成型表達(dá)PD-1,Sp2/0-Ag細(xì)胞無藥物刺激時(shí)弱表達(dá)PD-1,藥物刺激后PD-1表達(dá)大大增強(qiáng),約是未刺激時(shí)的10倍左右

3、:以C57BL/6J小鼠基因組為模板,根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測的結(jié)果擴(kuò)增小鼠PD-1基因不同長度的啟動(dòng)子和調(diào)控區(qū)序列,構(gòu)建含上游10種不同片段介導(dǎo)的熒光素酶表達(dá)載體pGL3-14(-1685bp～+49bp)、pGL3-19(-1127bp～+49bp)、pGL3-24(-714bp～+49bp)、pGL3-29(-227bp～+49bp)、pGL3-Control-PD1-1(-1685bp～-1128bp,CPD1)、pGL3-Contr

4、ol-PD1-2(-1127bp～-715bp,CPD2)、pGL3-Control-PD1-3(-714bp～-228bp,CPD3)、pGL3-Basic-PD1-1(-1685bp～-1128bp,BPD1)、pGL3-Basic-PD1-2(-1127bp～-715bp,BPD2)和pGL3-Basic-PD1-3(-714bp～-228bp,BPD3),將上述載體分別與pRL-SV40共轉(zhuǎn)染EL4和Sp2/0-Ag細(xì)胞,雙熒光

5、素酶報(bào)告結(jié)果顯示:pGL3-19活性最強(qiáng),pGL3-29次之,pGL3-14和pGL3-24活性均很弱;CPD1和CPD2的活性強(qiáng)于pGL3-Control,而CPD3的活性則弱于pGL3-Control,上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:-227bp～+49bp區(qū)域可能含有核心啟動(dòng)子,-1127bp～-715bp含有正調(diào)控元件,-714bp～-228bp區(qū)域含有負(fù)調(diào)控元件,-1685bp～-1128bp與-1127bp～-715bp之間可能存在協(xié)同

6、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),為進(jìn)一步闡明PD-1基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等奠定基礎(chǔ):在第二部分中,我們克隆了小鼠CTLA-4基因啟動(dòng)子并在紅色熒光蛋白腺相關(guān)病毒載體上驗(yàn)證了其功能;同時(shí)構(gòu)建了含驗(yàn)證小鼠FOXP3、LAG-3基因啟動(dòng)子的紅色和綠色熒光蛋白表達(dá)載體pDsRed-FOXP3和pEGFP-LAG3-1、pEGFP-LAG3-2、pEGFP-LAG3-3載體,為進(jìn)一步構(gòu)建pAAd-FOXP3-CFP-Helper和pAAd-LAG-3