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文檔簡介
1、黃曲霉毒素B1(AFB1)是一種毒性極強(qiáng)的環(huán)境致癌物,以往研究已證實(shí)AFB1暴露能導(dǎo)致肝損傷、肝癌等肝臟疾病。職業(yè)人群特別是糧食加工場所空氣中存在AFB1污染,但其與呼吸系統(tǒng)疾病的關(guān)系鮮受關(guān)注。AFB1是間接致癌物,需要經(jīng)過CYP酶的代謝活化,并通過活性中間代謝產(chǎn)物如AFB1-endo-8,9-環(huán)氧化物才能發(fā)揮其致癌性及強(qiáng)毒性。CYP2A13作為表達(dá)在呼吸道內(nèi)的肝外代謝酶,本課題組以往發(fā)現(xiàn)CYP2A13能夠代謝活化AFB1并引起支氣管上
2、皮細(xì)胞損傷和惡性轉(zhuǎn)化,但與呼吸系統(tǒng)損傷的關(guān)系尚未證實(shí)。
小鼠體內(nèi)的CYP2A5是人類CYP2A13的同源代謝酶,其代謝AFB1的活性與CYP2A13較接近。本研究通過構(gòu)建cyp2a5敲除小鼠,利用氣管滴注AFB1染毒,比較敲除小鼠和野生型小鼠的肺組織損傷效應(yīng)、炎癥反應(yīng)及其主要類型,試圖解析CYP2A5在AFB1所致小鼠肺損傷中的重要作用,為系統(tǒng)探討CYP2A13對(duì)AFB1的代謝活化以及與人群呼吸系統(tǒng)疾病的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
3、r> 第一部分:Cyp2a5全身性敲除小鼠的構(gòu)建及鑒定
目的:
構(gòu)建Cyp2a5基因敲除(KO)小鼠,為后續(xù)研究提供動(dòng)物模型。
方法:
構(gòu)建Cyp2a5基因打靶載體,通過電轉(zhuǎn)將打靶載體導(dǎo)入C57BL/6小鼠的ES細(xì)胞中,藥物篩選ES,經(jīng)PCR及Southern驗(yàn)證Knockout ES細(xì)胞;經(jīng)顯微注射注射入囊胚中;將囊胚移植到代孕母鼠體內(nèi);生產(chǎn)出嵌合體小鼠后與野生型小鼠雜交獲得雜合子F1代Kno
4、ckout小鼠。F1代小鼠提取鼠尾DNA進(jìn)行基因型鑒定,鑒定為陽性的互交擴(kuò)大繁殖生成F2;F2代小鼠提取鼠尾DNA進(jìn)行基因型鑒定,F(xiàn)2小鼠提取典型臟器的RNA進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。
結(jié)果:
嵌合體小鼠與野生型小鼠雜交產(chǎn)生13只F1代小鼠,經(jīng)PCR鑒定有4♂和4♀為陽性;F1代小鼠互交產(chǎn)生25只F2代小鼠,其中11只鑒定為雜合子,6只為野生型WT,8只為KO純合子,符合遺傳定律,性別分配均衡,未發(fā)現(xiàn)有胚胎致死及發(fā)育缺陷
5、;F2代小鼠中WT小鼠其肺臟、肝臟、腎臟均有Cyp2a5的表達(dá),而KO小鼠相應(yīng)臟器未發(fā)現(xiàn)Cyp2a5的表達(dá),提示Cyp2a5敲除小鼠構(gòu)建成功。
第二部分:AFB1對(duì)Cyp2a5敲除小鼠急性肺損傷的效應(yīng)評(píng)價(jià)
目的:
研究CYP2A5在氣管滴注AFB1所致小鼠急性肺損傷中的作用,為闡明CYP2A13在職業(yè)場所AFB1空氣暴露與呼吸系統(tǒng)疾病關(guān)系中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
方法:
建立經(jīng)氣管滴注AF
6、B1染毒的動(dòng)物模型,檢測WT小鼠和KO小鼠肺臟HE病理損傷程度、肺泡灌洗液(BALF)中乳酸脫氫酶(LDH)活性、總蛋白量、滲出細(xì)胞數(shù)量,評(píng)價(jià)兩種基因型小鼠的肺臟急性損傷程度;細(xì)胞涂片染色分析BALF中炎性細(xì)胞類型、免疫熒光分析肺組織中巨噬細(xì)胞的分布、芯片分析血清中炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子,評(píng)價(jià)兩種基因型小鼠肺臟炎癥的發(fā)生程度及可能的機(jī)制。
結(jié)果:
低劑量(1mg/kg)AFB1暴露1天后,敲除小鼠肺泡灌洗液中LDH活性、
7、蛋白含量、總細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著低于野生型小鼠;隨著暴露時(shí)間的增加,效應(yīng)指標(biāo)無顯著增加趨勢,而且兩種基因型小鼠效應(yīng)指標(biāo)間無顯著差異。高劑量(10mg/kg) AFB1暴露后,隨著暴露時(shí)間的增加,WT小鼠肺泡灌洗液中LDH活性、蛋白含量、總細(xì)胞計(jì)數(shù),病理損傷程度均呈顯著增加趨勢;在1、3、7天時(shí)間點(diǎn)敲除小鼠效應(yīng)指標(biāo)均顯著低于野生型小鼠。高劑量(10mg/kg)AFB1暴露1天后,野生型小鼠血清中的IL-6含量顯著高于敲除小鼠;隨著暴露時(shí)間的增加
8、,巨噬細(xì)胞的數(shù)量及所占比重呈增加趨勢。
結(jié)論:
1.我們構(gòu)建并成功獲得了Cyp2a5敲除小鼠的純合子,該小鼠形狀可以遺傳后代;是我們探討主要表達(dá)在人體呼吸系統(tǒng)中的CYP2A13代謝酶對(duì)外源化學(xué)物(比如AFB1)代謝活化的良好模型。
2.呼吸道暴露AFB1可以引起急性肺損傷,并且引出炎癥反應(yīng):而在此過程中,小鼠肺臟內(nèi)CYP2A5對(duì)AFB1的代謝活化起重要作用
3.不同劑量的AFB1暴露毒效應(yīng)不同,1
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