Twist-2在Kupffer細胞內(nèi)毒素耐受形成機制的實驗研究.pdf

1、膿毒癥是各種嚴重創(chuàng)傷、感染、缺血再灌注損傷及外科大手術(shù)常見的并發(fā)癥，至今在臨床上仍缺乏有效的治療手段，由嚴重膿毒癥和膿毒癥性休克導(dǎo)致的病死率高達30％左右。膿毒癥具有患病率高、死亡率高、治療費用高的“三高”現(xiàn)象，臨床上膿毒癥大多數(shù)由革蘭氏陰性(G-)細菌感染所致。內(nèi)毒素(Endotoxin)又稱脂多糖(lipoplysacchride，LPS)是G-細菌細胞壁上的主要成分和主要的致病成分，其具有廣泛的生物活性，通過引起炎癥細胞釋放TNF

2、-α等大量炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)及多器官功能障礙。
　　 內(nèi)毒素耐受(endotoxin tolerance，ET)是指預(yù)先以小劑量LPS或其同系物刺激動物或單核-巨噬細胞系統(tǒng)(Mononuclear phagacytic system，MPS)隨后再用致死劑量的LPS攻擊時，表現(xiàn)為對LPS的低反應(yīng)性，以保護機體免受LPS致死性

3、毒性反應(yīng)的現(xiàn)象，稱內(nèi)毒素耐受。內(nèi)毒素耐受被認為是生物在長期進化過程中形成的一種負反饋調(diào)節(jié)機制，是一種主動性適應(yīng)性應(yīng)答，總體來說內(nèi)毒素耐受時的細胞因子低表達對機體的影響是積極的。目前，關(guān)于內(nèi)毒素耐受及形成機制仍未完全闡明。
　　 NF-κB是一個多功能核轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控促炎癥基因的合成和釋放中起決定性作用，其過度活化并啟動相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄，可產(chǎn)生和釋放大量炎性介質(zhì)，從而引起“介質(zhì)病”。在基礎(chǔ)情況下，NF-κB二聚體被NF-κB抑制蛋

4、白(inhibitors of NF-κB，IκB)隱沒于細胞質(zhì)中。因此，NF-κB活化的前提條件是IκB的降解或去除NF-κB母核的抑制區(qū)域。激活的NF-κB復(fù)合物轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)，與靶基因啟動子結(jié)合后行使其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。目前大量的研究證據(jù)表明：細胞中存在著NF-κB激活的負性調(diào)節(jié)通路，即在NF-κB激活的同時，也進行著NF-κB負性調(diào)節(jié)因子的的合成及再合成。該負性調(diào)節(jié)通路的存在能夠限制和阻斷前炎癥因子誘導(dǎo)的NF-κB的活性，以限制炎癥性

5、損傷是至關(guān)重要的。
　　 最近研究發(fā)現(xiàn)，扭蛋白Twist-2是核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的負性調(diào)節(jié)的重要相關(guān)蛋白，它在參與負性NF-κB調(diào)節(jié)通路及減緩炎癥的應(yīng)答中起到重要的作用，從而有可能參與內(nèi)毒素耐受的形成機制。本研究即通過內(nèi)毒素預(yù)處理建立內(nèi)毒素耐受小鼠模型及體外Kupffer細胞模型，觀察在內(nèi)毒毒耐受狀態(tài)下機體及細胞中Twist-2表達的變化，初步確定Twist-2與內(nèi)毒素耐受的關(guān)系；進而采用特異性RNA干擾技術(shù)在體外沉寂Twis

6、t-2的基因表達，觀察Kupffer細胞內(nèi)毒素耐受性的改變；由此闡明Twist-2在內(nèi)毒素耐受形成中的作用及機制，從而為膿毒癥的臨床治療提供新的干預(yù)靶點和手段。
　　 第一部分、Twist-2在內(nèi)毒素耐受小鼠肝組織中
　　 目的；建立內(nèi)毒素耐受小鼠模型，觀察內(nèi)毒素耐受小鼠接受大劑量LPS刺激前后Twist-2在肝組織中的表達變化情況，從機體水平初步探討Twist-2與內(nèi)毒素耐受之間的關(guān)系。
　　 方法：通過對實驗

7、動物處理方式的不同，隨機分為內(nèi)毒素非耐受組(NETT)和耐受組(ETT)。比較兩組實驗動物的一般情況；光鏡觀察肝組織病理學(xué)改變；電鏡觀察肝臟細胞超微結(jié)構(gòu)改變；轉(zhuǎn)錄因子分析試劑盒檢測NF-κB活性；酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測血漿中的TNF-α水平；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測肝組織TNF-α及Twist-2的mRNA表達水平。
　　 結(jié)果：
　　 (1)成功建立了內(nèi)毒素耐受小鼠模型；
　　 (2)

8、EET組小鼠各時相點血漿TNF-α含量、肝組織中TNF-α表達明顯減弱、肝組織中NF-κB活性顯著降低(P<0.05)；
　　 (3)NETT組在LPS刺激24h后才能在肝組織中檢測到Twist-2的mRNA表達，而ETT組肝組織中Twist-2 mRNA表達在0h時已能檢測，并在LPS刺激后迅速上調(diào)，于6h時達高峰，24h時其表達強度仍為非耐受組2.5倍。
　　 結(jié)論：LPS預(yù)處理能成功誘導(dǎo)小鼠內(nèi)毒素耐受；肝組織中Tw

9、ist-2高表達表達及Kupffer細胞活化受到抑制可能與內(nèi)毒素耐受的形成有關(guān)。
　　 第二部分、Twist-2在內(nèi)毒素耐受Kupffer細胞中的表達及意義
　　 目的：觀察內(nèi)毒素耐受時Twist-2在kupffer細胞中表達變化情況，并探討其在Kupffer細胞內(nèi)毒素耐受中的作用及意義。
　　 方法：通過分離培養(yǎng)kupffer細胞，根據(jù)處理方式的不同分為非耐受組(NETT)和耐受組(ETT)。分別用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶

10、鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測kupffer細胞中Twist-2；TNF-αmRNA表達水平；蛋白印跡法(WesternBlotting)檢測Twist-2蛋白表達情況；以及Trans AM NF-κB Kit檢測kupffer細胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB)的相對活性；用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞培養(yǎng)液中TNF-α的水平。
　　 結(jié)果：
　　 (1)成功誘導(dǎo)內(nèi)毒素耐受Kupffer細胞模型；
　　 (2)內(nèi)

11、毒素非耐受組的NF-κB相對活性、TNF-α含量和表達均較耐受組明顯升高(P<0.05)，
　　 (3)RT-PCR和Western blotting分析顯示：NETT組細胞在LPS刺激24h后才能檢測出Twist-2 mRNA和Twist-2蛋白的表達，而ETT。組細胞在LPS刺激前已可檢測到Twist-2的基因表達，且該表達隨LPS刺激的持續(xù)而維持在較高水平。
　　 結(jié)論：內(nèi)毒素耐受狀態(tài)下，Twist-2基因轉(zhuǎn)錄和翻

12、譯水平明顯上調(diào)，而Kupffer細胞的活性受到明顯抑制，但未完全喪失，提示Twist-2具有負性調(diào)控KCs的活性的作用，在內(nèi)毒素耐受的形成中起重要作用，但并非內(nèi)毒素耐受的唯一機制，可能還有其它機制在內(nèi)毒素耐受的形成中發(fā)揮作用。
　　 第三部分、
　　 目的：應(yīng)用RNA干擾技術(shù)(RNAi)沉寂Kupffer細胞Twist-2基因表達，觀察細胞內(nèi)毒素耐受性的改變，探討Twist-2在內(nèi)毒素耐受形成中的作用。
　　 方

13、法：應(yīng)用Twist-2特異性shRNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染Kupffer細胞，以載體pGenesil-1轉(zhuǎn)染為陰性對照，分為pTwist-2-shRNA轉(zhuǎn)染組和pGenesil-1組，兩組先經(jīng)10ng/ml LPS預(yù)處理后，再用100ng/ml LPS進行孵育；用ELISA檢測培養(yǎng)液中的TNF-α水平；RT-PCR檢測細胞中的Twist-2 mRNA表達；用TransAM NF-κB Kit檢測細胞中NF-κB活性，Western blottin

14、g檢測其對Twist-2蛋白表達。
　　 結(jié)果：
　　 (1)pGenesil-1載體轉(zhuǎn)染對Twist-2 mRNA表達無明顯抑制作用，可作為陰性對照。
　　 (2)pGenesil-1組中Twist-2 mRNA和Twist-2蛋白水平明顯高于pTwist-2-shRNA轉(zhuǎn)染組，而pGenesil-1組細胞培養(yǎng)液中TNF-α水平、NF-κB活性明顯低于pTwist-2-shRNA轉(zhuǎn)染組，各項指標(biāo)比較均有顯著性差