低能N+注入介導(dǎo)秦艽基因組DNA轉(zhuǎn)化酵母的研究.pdf

1、龍膽苦苷(Gentiopicroside)為裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類化合物，大量存在于藥用植物秦艽(Gentianamacrophylla,G.macrophylla)中，是評價龍膽屬藥材的主要指標，具有抗氧化、抗炎、保肝、利膽及抗腫瘤等作用。近年來，臨床用藥量的增加、多年的過渡采挖，造成了野生秦艽資源的嚴重匱乏。人工栽培存活率低，藥材質(zhì)量下降，受季節(jié)變化影響明顯，龍膽苦苷產(chǎn)量低等問題導(dǎo)致龍膽苦苷的供應(yīng)難以滿足臨床應(yīng)用的需要。因此，迫切需要尋求

2、及擴大龍膽苦苷新型藥源途經(jīng)來滿足其日益增長的需求。隨著低能離子注入生物工程學(xué)的發(fā)展，低能離子注入因其獨特的反應(yīng)機制及誘變效應(yīng)，使其在微生物、植物育種及農(nóng)作物改良方面具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　 本論文首先以谷胱甘肽(Glutathione，GSH)產(chǎn)量為指標對多形漢遜酵母DL-1(HansenulapolymorphaDL-1，H.polymorphaDL-1)培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，建立了兩階段溫度調(diào)控發(fā)酵法生產(chǎn)GSH。在此基礎(chǔ)上，對

3、N+注入H.polymorphaDL-1的條件進行了探索，確定了最佳的離子注入?yún)?shù)。最后，利用低能離子注入技術(shù)介導(dǎo)秦艽基因組DNA轉(zhuǎn)化酵母，構(gòu)建產(chǎn)龍膽苦苷的酵母工程菌，為解析龍膽苦苷生物合成基因提供實踐材料，為后續(xù)探索遺傳改造微生物生產(chǎn)倍半萜類物質(zhì)提供理論和數(shù)據(jù)支持，對開展藥用植物基因資源開發(fā)和保護具有重要意義。研究結(jié)果如下:
　　 (1)建立了一種提高谷胱甘肽產(chǎn)量的方法。通過單因素試驗確定了H.polymorphaDL-1的最

4、適生長溫度、GSH合成的最佳溫度和培養(yǎng)基初始pH，其分別為30℃、37℃和pH6.5;接著，通過變溫調(diào)控分批發(fā)酵，確定了最佳變溫條件為:45℃培養(yǎng)12h后將溫度降低為37℃繼續(xù)培養(yǎng)36h，采用該方法搖瓶發(fā)酵后GSH總量及GSH含量分別為416.13mg/L和103.15mg/g，比恒溫培養(yǎng)(37℃)分別提高了69.6％和55.4％;最后，通過5L發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)，生物量(DryCellWeight，DCW)和GSH產(chǎn)量分別達42.35g/

5、L和927.68mg/L。表明變溫調(diào)控方法可用于提高H.polymorphaDL-1發(fā)酵生產(chǎn)GSH的產(chǎn)量。
　　 (2)分別以注入后酵母細胞的存活率及產(chǎn)龍膽苦苷能力為依據(jù)，確定了N+注入轉(zhuǎn)化H.polymorphaDL-1的最佳參數(shù)為:注入能量，25keV;劑量，2.5×1016ion/cm2，10-3真空條件下，脈沖注入10s，間隔10s。用上述條件處理后，H.polymorphaDL-1的正突變率為38％，通過ZnCl2抗性

6、篩選獲得了一株GSH突變菌株，搖瓶變溫發(fā)酵后DCW達6.24g/L，相對于原始菌株提高了9.09％;GSH產(chǎn)量為337.16mg/L，比原始菌株提高1.56倍;繼代培養(yǎng)八代GSH產(chǎn)量變化不顯著。將該菌命名為Hansenulapolymorpha18(HP18)，已申請保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為:2012年9月29日;保藏號為:CGMCC.NO.6642。
　　 (3)建立了產(chǎn)龍膽苦苷酵

7、母工程菌的快速篩選方法。首先采用顏色反應(yīng)進行定性分析，然后采用TLC及RP-HPLC法進行定量檢測，具體如下:
　　 a顏色反應(yīng)酸水解反應(yīng)(10％H2SO4)、Molish及Fehling試驗;2％CuSO4、Weiggering反應(yīng)及香草醛試驗;20％NaOH和鹽酸-鎂粉反應(yīng)。
　　 b高效液相色譜法測定龍膽苦苷含量的色譜條件:色譜柱為DiamonsilC18柱（250mm×4.6mm，5μm）;紫外檢測器:Water

8、s2487;流動相為甲醇:水(30∶70);在室溫下測定，檢測波長:270nm;進樣量:20μl;流速:1.0nh/min。
　　 在該色譜條件下檢測秦艽中龍膽苦苷含量，平均回收率為99.24％，RSD=1.16％，精密度試驗RSD=2.2％，龍膽苦苷的保留時間tR=12.3min。
　　 (4)采用GD2611-01植物基因組DNA提取試劑盒提取秦艽基因組DNA，用紫外分光光度法及1％瓊脂糖凝膠電泳測定DNA純度為OD

9、260/OD280=1.8±0.02，濃度約為1μg/μl，無蛋白質(zhì)、RNA、多糖等雜質(zhì)。
　　 (5)低能N+注入介導(dǎo)秦艽基因組DNA轉(zhuǎn)化H.polymorphaDL-1，存活率低，通過顏色反應(yīng)進行初篩，呈陽性的菌株30株，占隨機挑選總數(shù)的3.98％;經(jīng)搖瓶復(fù)篩及RP-HPLC法分析獲得一株產(chǎn)龍膽苦苷的酵母工程菌，編號為DL10049。
　　 (6)酵母工程菌DL10049用無機培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵72h龍膽苦苷產(chǎn)量為2.5