利用低能離子注入轉(zhuǎn)化酵母技術(shù)全合成銀杏內(nèi)酯B的研究.pdf

1、藥用植物銀杏（Ginkgo bilobaL.），起源于幾億年前，是目前最古老的孑遺植物之一，具有顯著的藥理活性和臨床價(jià)值。銀杏內(nèi)酯(ginkgolides)為二萜類酯化合物，是銀杏葉中主要的藥用成份，包括銀杏內(nèi)酯A（ginkgolideA，GA）、銀杏內(nèi)酯B（ginkgolide B，GB）、銀杏內(nèi)酯C(ginkgolideC，GC)、銀杏內(nèi)脂M(ginkgolide M，GM)、銀杏內(nèi)脂J（ginkgolide J，GJ）。研究表明，

2、銀杏內(nèi)酯B被公認(rèn)為是目前最有效的血小板活化因子(plateletactivating factor, PAF)受體拮抗劑，能有效的抑制血栓的形成，被廣泛的應(yīng)用于心腦血管系統(tǒng)疾病。近年來，隨著心腦血管疾病發(fā)病率的增加，銀杏內(nèi)酯B的臨床需求也在逐年擴(kuò)大，致使銀杏天然植被資源被過度開發(fā)，銀杏內(nèi)酯B的藥源受到極大的限制。
　　為了解決銀杏內(nèi)酯B的藥源問題，本文利用一種新的方法，從合成生物學(xué)角度，借助低能離子注入驅(qū)動(dòng)介導(dǎo)銀杏基因組DNA遺傳

3、轉(zhuǎn)化漢遜酵母，通過對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行高通量改造，并結(jié)合PCR技術(shù)、TLC和HPLC等方法對(duì)離子束重組酵母進(jìn)行定性篩選，以獲得能生物合成銀杏內(nèi)酯B的重組酵母菌，為銀杏內(nèi)酯B的藥源開發(fā)提供一種新途徑。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　(1)優(yōu)化了基因組提取方法，獲得了一種銀杏基因組DNA的高效提取方法。通過傳統(tǒng)CTAB法、改良SDS法、改良CTAB法三種基因組提取方法的比較，結(jié)果表明，改良CTAB法能快速、高效地提取銀杏基因組DNA，提

4、取濃度為2673.2 ng/μL，OD260/OD280比值為1.84。
　　(2)成功建立了以銀杏內(nèi)酯B生物合成途徑中關(guān)鍵酶為分子篩選標(biāo)記的PCR高通量篩選體系。以關(guān)鍵酶GGPPS、MECPS、MECT為分子標(biāo)記，依據(jù)關(guān)鍵酶氨基酸保守序列，設(shè)計(jì)簡并引物，以銀杏基因組DNA和漢遜酵母基因組DNA為擴(kuò)增模板，成功建立了PCR高通量初篩方法。
　　(3)明確了低能N+注入介導(dǎo)植物基因組DNA轉(zhuǎn)化多形漢遜酵母的注入?yún)?shù)。具體注入條

5、件為:注入能量25 keV，注入劑量25×1015 ion/cm2，真空度10-3 Pa，脈沖10s，間隔10s。
　　(4)獲得了能產(chǎn)銀杏內(nèi)酯B重組酵母菌。首先以注入后的所有重組酵母菌株為研究對(duì)象，通過PCR初篩獲得6株候選重組酵母菌;再結(jié)合顏色反應(yīng)、TLC、HPLC等方法對(duì)候選重組酵母菌進(jìn)行復(fù)篩，得到4株能產(chǎn)銀杏內(nèi)酯B的重組酵母菌，其中最高產(chǎn)量為1.212 mg/L，菌株編號(hào)為DL-00627。
　　(5)開展了對(duì)重組酵