重組人內(nèi)抑素對(duì)兔耳增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制研究.pdf

1、增生性瘢痕(hypertrophic scar, HS)是一種皮膚軟組織損傷之后機(jī)體過度修復(fù)導(dǎo)致的皮膚纖維化疾病，手術(shù)后的發(fā)病率可達(dá)40%-70%，而燒傷后的發(fā)病率更高達(dá)91%。HS主要的臨床表現(xiàn)為損傷局部組織凸于正常皮膚的異常增生，并伴有疼痛、瘙癢等機(jī)體感覺不適，同時(shí)給患者帶來局部組織外觀和功能上的改變，如局部關(guān)節(jié)部位的瘢痕性攣縮等，嚴(yán)重影響了患者的身心健康。其確切的發(fā)病原因和機(jī)制目前尚未完全明確，臨床上也缺乏特異性的治療措施，而單純

2、的手術(shù)切除會(huì)產(chǎn)生新的瘢痕。增生性瘢痕成纖維細(xì)胞(hypertrophic scar fibroblasts, HSFs)是HS發(fā)生和發(fā)展過程中的主要效應(yīng)細(xì)胞，且HSFs增殖和凋亡之間的不平衡也是臨床上HS過度增生和持續(xù)存在的重要原因，因而抑制HSFs增殖和(或)促進(jìn)HSFs凋亡可以成為臨床上治療HS的一個(gè)重要突破口。
　　內(nèi)抑素(endostatin)是 O’Reilly等人從小鼠血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中分離純化得到的一種蛋白

3、質(zhì)，共184個(gè)氨基酸殘基。先前的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)抑素可特異性抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，通過進(jìn)一步的研究證實(shí)，內(nèi)抑素可以直接抑制部分腫瘤細(xì)胞增殖、遷移并誘導(dǎo)凋亡從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。我們?cè)缙诘难芯孔C實(shí)重組人內(nèi)抑素(recombinant human endostatin, rhEndostatin)可特異性抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡；Ren等證明內(nèi)抑素可以通過降低瘢痕組織中bcl-2的表達(dá)和抑制瘢痕內(nèi)新生血管的形成來抑制瘢痕

4、的增生。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)rhEndostatin(6.25,12.5,25,50,100μg/ml)可以直接抑制HSFs增殖，本實(shí)驗(yàn)正是在本課題組前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討 rhEndostatin(100μg/ml)對(duì)兔耳HSFs凋亡的作用并探討其中凋亡相應(yīng)的分子機(jī)制，從而為HS的臨床治療以及尋找藥物治療新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　目的：觀察rhEndostatin對(duì)HSFs凋亡的影響，探討其作用的部分細(xì)胞與分子機(jī)

5、制。
　　方法：①HS模型制備與鑒定：新西蘭大耳兔8只，分為正常組(2只)和HS模型組(6只)，模型組大耳兔建立兔耳HS模型；術(shù)后第28天，瘢痕形成；隨機(jī)取兩只兔耳瘢痕組織和正常兔耳皮膚行組織學(xué)觀察，鑒定HS。
　?、贖SFs分離培養(yǎng)和鑒定：采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)細(xì)胞，取第3代(傳2代)細(xì)胞行波形蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定HSFs。后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用第3代細(xì)胞。
　　③HSFs凋亡情況檢測(cè)：將模型組細(xì)胞分為未處理組、內(nèi)抑素處理組

6、(100μg/ml)和5-氟尿嘧啶處理組(500μg/ml)，流式細(xì)胞儀(FCM)對(duì)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。
　　④ HSFs凋亡相關(guān)基因與蛋白檢測(cè)：實(shí)時(shí)熒光定量 PCR法檢測(cè) c-fos, c-jun, NF-κB, fas, caspase-3, bcl-2和p53 mRNA；Western Blot法檢測(cè)相應(yīng)蛋白表達(dá)。
　?、軭SFs胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+檢測(cè)：Fluo-4/AM作為Ca2+指示劑，其終濃度為100?g/ml

7、rhEndostatin灌流 HSFs，同時(shí)用激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope, CLSM)動(dòng)態(tài)觀察和記錄HSFs在有無Ca2+液時(shí)胞質(zhì)中的Ca2+熒光強(qiáng)度(fluorescence intensity, FI)變化，檢測(cè)rhEndostatin對(duì)HSFs胞質(zhì)Ca2+濃度(cytosolic free calcium concentration)[Ca2+]i的影響。
　　結(jié)果

8、：①術(shù)后28天，HS即形成。HE染色結(jié)果顯示瘢痕組織較周圍正常皮膚明顯增厚，同時(shí)瘢痕組織內(nèi)的膠原纖維也明顯變粗變大，呈現(xiàn)出旋渦或結(jié)節(jié)狀，形成膠原結(jié)節(jié)；同時(shí)伴有大量的成纖維細(xì)胞增殖以及小血管增生。
　?、诓ㄐ蔚鞍酌庖呒?xì)胞化學(xué)染色對(duì)第3代(傳2代)細(xì)胞進(jìn)行鑒定的結(jié)果顯示：細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含有大量的棕黃色顆粒，呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞特性。
　　③ FCM分析結(jié)果顯示，rhEndostatin(100μg/ml)可促進(jìn)HSFs早期及晚期凋亡，且以

9、早期凋亡更為顯著,分別為(10.78±0.06)%、(2.12±0.04)%，差異較未處理對(duì)照組HSFs均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　?、軐?shí)時(shí)熒光定量PCR及Western Blot分析結(jié)果顯示，與未處理對(duì)照組HSFs相比較，rhEndostatin(100μg/ml)能明顯降低 HSFs c-jun, c-fos, NF-κB, fas, p53, caspase-3和bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平(P<0.01)

10、。
　?、?CLSM檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)細(xì)胞處于無 Ca2+液(D-Hanks緩沖液)中時(shí)，rhEndostatin(100?g/ml)不能引起HSFs胞質(zhì)內(nèi)Ca2+FI的改變。當(dāng)細(xì)胞外緩沖液為有Ca2+液(Hanks緩沖液)時(shí)，終濃度為100?g/ml rhEndostatin灌流HSFs可使胞質(zhì)Ca2+FI急劇增加達(dá)峰值，隨即熒光開始減弱，F(xiàn)I隨時(shí)間而緩慢下降。
　　結(jié)論：① rhEndostatin可促進(jìn)HSFs凋亡。