積雪草酸對小鼠心肌細(xì)胞凋亡和心力衰竭的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述:
　　第一章 積雪草酸對乳酸誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究
　　目的:
　　研究積雪草酸(Asiatic acid,AA)對乳酸(Lactate)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,并探討其可能的機(jī)制。
　　方法:
　　1.體外培養(yǎng)新生乳大鼠的原代心肌細(xì)胞,采用CCK-8法測定不同濃度AA(0、5、10、20、30μmol/L)和Lactate(0、2.5、5、10、20、

2、40mmol/L)對心肌細(xì)胞活力的影響。本實驗中采用Lactate(20mmol/L)刺激心肌細(xì)胞24h來建立心肌細(xì)胞Lactate損傷模型,研究AA(20μmol/L)預(yù)處理24h對心肌細(xì)胞Lactate損傷的保護(hù)作用和機(jī)制。
　　2.實驗分為4組:①正常對照組(Control組):不加Lactate和AA處理;②AA組:細(xì)胞中只加AA(20μmol/L)預(yù)處理24h;③Lactate組:細(xì)胞只加Lactate(20mmol/L

3、)處理24h;④Lactate+AA組:AA(20μmol/L)預(yù)處理24h,再加Lactate(20mmol/L)處理24h。
　　3.經(jīng)DCFH-DA染色,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)濃度。
　　4.經(jīng)JC-1染色,用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡觀測線粒體膜電位。
　　5.經(jīng)Annexin V-FITC/PI染色,用流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞凋亡。
　　6.經(jīng)T

4、UNEL染色,熒光顯微鏡觀察心肌細(xì)胞凋亡。
　　7.提取心肌細(xì)胞胞質(zhì)和線粒體蛋白,Western blot法檢測心肌細(xì)胞胞質(zhì)Cytochrome c、Cleaved-caspase9、Cleaved-caspase3以及線粒體單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白1(Monocarboxylate transporter1,MCT1)等蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.Lactate(20mmol/L)刺激24h導(dǎo)致心肌細(xì)胞活力顯著下降,細(xì)胞

5、內(nèi)ROS濃度顯著升高,線粒體膜電位顯著下降,心肌細(xì)胞凋亡率顯著增加,MCT1、Cytochrome c、Cleaved-caspase9和Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)均顯著增加。
　　2.AA(20μmol/L)預(yù)處理24h顯著抑制乳酸誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷,降低細(xì)胞內(nèi)ROS的生成,抑制線粒體膜電位的下降,降低心肌細(xì)胞凋亡率。并顯著增加線粒體MCT1蛋白的表達(dá),降低Cytochrome c、Cleaved-caspase9

6、和Cleaved-caspase3蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　積雪草酸可以保護(hù)心肌細(xì)胞,其機(jī)制包括抑制氧化應(yīng)激和線粒體凋亡通路活化,以及上調(diào)線粒體MCT1蛋白的表達(dá)。
　　第二章 積雪草酸對小鼠主動脈弓縮窄術(shù)后心力衰竭的保護(hù)作用和機(jī)制研究
　　目的:
　　研究積雪草酸（AA）對小鼠心力衰竭的保護(hù)作用，并探討其可能的保護(hù)機(jī)制。
　　方法:
　　1.采用C57BL/6小鼠，通過主動脈弓縮窄術(shù)(Tr

7、ansverse aortic coarctation，TAC)建立心力衰竭的動物模型，于術(shù)后第8周末使用心臟超聲檢測小鼠心室大小及心功能，處死小鼠后取出心臟，分離左心室，計算左心室重量/體重比(Left ventricular rweight/body weight,LVW/BW)。
　　2.實驗分為三組:①假手術(shù)組（Sham組）;②單純手術(shù)組（TAC組）;③TAC+AA組:TAC術(shù)后第5-8周，AA (100 mg/kg)灌胃

8、，每天一次。每組10只小鼠。
　　3.比色法測定心肌組織內(nèi)乳酸和丙二醛(MDA)濃度。
　　4.經(jīng)TUNEL染色，熒光顯微鏡觀察心肌細(xì)胞凋亡。
　　5.提取心肌細(xì)胞胞質(zhì)和線粒體蛋白，Western blot法檢測心肌組織胞質(zhì)Cytochrome c、Cleaved-caspase 9和Cleaved-caspase 3以及線粒體單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白1(Monocarboxylate transporter 1，MCT1)等蛋

9、白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.TAC術(shù)后8周小鼠心臟明顯增大，LVW/BW明顯增加，心超顯示出現(xiàn)明顯的心肌肥厚，同時心室腔明顯擴(kuò)張，心功能明顯下降，出現(xiàn)心力衰竭。而AA治療后可以顯著降低TAC小鼠的LVW/BW，減輕心肌肥厚，抑制心腔擴(kuò)張，改善心功能。
　　2.TAC術(shù)后8周小鼠心肌組織中乳酸濃度和線粒體MCT1表達(dá)均顯著增加。AA治療可以顯著降低TAC小鼠心肌組織內(nèi)乳酸濃度，并進(jìn)一步增加線粒體MCT1蛋白的表達(dá)。<

10、br>　　3.TAC術(shù)后8周小鼠心肌組織內(nèi)MDA含量顯著升高，心肌細(xì)胞凋亡率顯著增加，線粒體凋亡相關(guān)蛋白（Cytochrome c，Cleaved caspase-9和Cleaved caspase-3）的表達(dá)也顯著增加。AA治療可以顯著降低TAC小鼠心肌組織內(nèi)MDA含量和線粒體凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論:
　　積雪草酸可以抑制心力衰竭的發(fā)生發(fā)展，其機(jī)制包括抑制氧化應(yīng)激和線粒體凋亡通路活化，以及上調(diào)線粒