補(bǔ)體復(fù)合物在大鼠骨性關(guān)節(jié)炎模型中表達(dá)的研究.pdf

1、背景及目的：
　　骨性關(guān)節(jié)炎（OA）在全世界范圍內(nèi)都被人們所熟知，主要累及膝關(guān)節(jié)，是老人下肢致殘的主要危險(xiǎn)因素。國內(nèi)外眾多學(xué)者多年來進(jìn)行大量不懈的研究，但其確切的病因及發(fā)病機(jī)制仍不甚明了。OA治療主要針對(duì)三個(gè)方面：減輕疼痛、改善功能、延緩或阻止疾病進(jìn)展，但現(xiàn)階段仍缺乏早期有效的治療，治療方法主要包括非藥物保守治療、非甾體類抗炎藥緩解疼痛、氨基糖苷類等營養(yǎng)軟骨藥以及關(guān)節(jié)潤滑劑透明質(zhì)酸鈉。但這些治療均不針對(duì)發(fā)病病理機(jī)制，不能很好的控制

2、疾病進(jìn)展，最終患者不得不進(jìn)行關(guān)節(jié)置換，不僅給患者造成負(fù)擔(dān)，也給國家衛(wèi)生健康系統(tǒng)造成巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此深入探究OA病理損傷機(jī)制，早期針對(duì)病因預(yù)防及治療至關(guān)重要。越來越多的研究表明OA中，滑膜是低級(jí)別的，滑膜炎不是造成軟骨缺損的主要原因。早在上世紀(jì)就有研究指出OA滑膜及軟骨中存在補(bǔ)體系統(tǒng)的激活，但是補(bǔ)體終末復(fù)合物MAC在滑膜及軟骨中是否都能最終形成，滑膜和軟骨誰起主要的病理角色仍不甚明了。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠骨性關(guān)節(jié)炎模型探討補(bǔ)體復(fù)合物MAC

3、是否在OA軟骨及滑膜中起一定的病理作用，是否是OA進(jìn)展中的主要病理因素之一。
　　方法：
　　第一部分動(dòng)物模型建立及標(biāo)本檢測
　　1)動(dòng)物模型建立及病理評(píng)分：將30只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、4周組、8周組、12周組。手術(shù)組每組10只，取大鼠后肢一側(cè)膝關(guān)節(jié)行前交叉韌帶切斷加部分內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)制造骨性關(guān)節(jié)炎模型；另一側(cè)僅切開皮膚暴露關(guān)節(jié)腔作為對(duì)照組。手術(shù)后4周，8周及12周取兩側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨行大體觀察、HE染色、番紅 O-

4、固綠染色、甲苯胺藍(lán)染色，估計(jì)軟骨退變程度以及進(jìn)行組織病理學(xué)的Mankin評(píng)分，滑膜僅行HE染色后行病理評(píng)分。
　　2)應(yīng)用免疫組化、Western Blot及Elisa技術(shù)檢測軟骨及滑膜中MAC沉積情況。
　　第二部分體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)及補(bǔ)體攻擊實(shí)驗(yàn)
　　1)軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定：原代培養(yǎng)大鼠軟骨細(xì)胞，應(yīng)用甲苯胺藍(lán)染色及Ⅱ型膠原免疫熒光鑒定軟骨細(xì)胞。
　　2)補(bǔ)體攻擊實(shí)驗(yàn)及免疫熒光檢測MAC形成：取不同濃度血清攻

5、擊軟骨細(xì)胞，并行免疫熒光檢測MAC在軟骨細(xì)胞表面沉積情況。
　　結(jié)果：
　　第一部分動(dòng)物模型建立及標(biāo)本檢測
　　1)動(dòng)物模型建立及病理評(píng)分：與對(duì)照組相比，手術(shù)組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨4周，8周及12周后呈現(xiàn)軟骨粗糙，糜爛，裂隙形成，缺損及骨贅形成等早中晚期OA表現(xiàn)。Mankin評(píng)分:對(duì)照組(0.11±0.17)分，4周組(3.89±1.31)分，8周組(8.17±1.67)分，12周組(12.89±1.05)分，各組間相比均有

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.01）,損傷逐漸加重?；ぴu(píng)分：對(duì)照組：(0.00±0.00)分，1周組：(3.47±0.25)分，2周組：(4.58±0.51)分，4周組：(5.17±0.75)分，8周組：(4.17±0.75)分，12周組：(2.83±0.75)分，各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）,炎癥逐漸降低。
　　2)免疫組化軟骨細(xì)胞細(xì)胞膜周圍出現(xiàn)環(huán)形MAC沉積，滑膜中沒有MAC。蛋白質(zhì)印跡發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組有MAC條帶，對(duì)照組沒有。應(yīng)用E

7、lisa法檢測后，可見OA軟骨加入血清后隨著孵育時(shí)間延長，MAC量逐漸增加，而滑膜與PBS則趨勢相近。
　　第二部分體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)及補(bǔ)體攻擊實(shí)驗(yàn)
　　1)軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定：軟骨細(xì)胞生長良好，呈三角形、多邊形或長梭形。甲苯胺藍(lán)染色后可見軟骨細(xì)胞呈多邊形、三角形、長梭形或類圓形，軟骨細(xì)胞基質(zhì)被染成淺藍(lán)色，細(xì)胞核染成深藍(lán)。Ⅱ型膠原免疫熒光可見細(xì)胞質(zhì)染成紅色。細(xì)胞呈現(xiàn)多邊形或類圓形。
　　2)補(bǔ)體攻擊實(shí)驗(yàn)及免疫熒光檢測