腫瘤微環(huán)境響應(yīng)性化藥-基因共轉(zhuǎn)運(yùn)載體的構(gòu)建及作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：以新型功能化單壁碳納米管（SWCNTs）為載體，負(fù)載抗腫瘤藥阿霉素（DOX）和抗凋亡基因survivin siRNA，構(gòu)建腫瘤微環(huán)境響應(yīng)性化藥與基因共轉(zhuǎn)運(yùn)的靶向納米載體，并對功能化修飾的 SWCNTs進(jìn)行物理化學(xué)性質(zhì)的表征，考察其體外藥物釋放、細(xì)胞毒性、細(xì)胞攝取、細(xì)胞內(nèi)定位、蛋白表達(dá)、凋亡效果，并進(jìn)一步評價(jià)其體內(nèi)抗腫瘤效果，為化藥/基因共轉(zhuǎn)運(yùn)靶向納米載體的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：采用強(qiáng)酸對SWCNTs進(jìn)行純化氧化，得到

2、氧化的SWCNTs（O-SWCNTs）。將兩性離子型單體-甜菜堿（Betaines）共價(jià)修飾在聚乙烯亞胺（PEI）上形成PEI-Betaines（PB），隨后聚合物單體 PB酰胺共價(jià)結(jié)合在 O-SWCNTs上，形成SWCNTs-PEI-Betaines（SPB），使其具有pH響應(yīng)性溶酶體逃逸能力。DOX以π-π共軛的方式吸附在 SPB表面，通過DSPE-PEG2000-Mal將靶向穿透肽 BR2連接在DOX-SPB上，構(gòu)建了化藥靶向納米

3、載體 DOX-SWCNTs-PEI-Betaines-BR2（DOX-SPBB）。將survivin siRNA靜電吸附在功能化SWCNTs表面，即構(gòu)建了化藥/基因共轉(zhuǎn)運(yùn)靶向納米載體 DOX-SWCNTs-PEI-Betaines-BR2-siRNA（DOX-SPBB-siRNA）。利用傅里葉紅外光譜（FT-IR）、紫外-可見光譜（UV-Vis）、X-射線衍射光譜（XRD）、熱重分析（TGA）、透射電鏡（TEM）等手段對PB修飾的SWC

4、NTs進(jìn)行表征分析。采用WST-1試劑盒考察SPB的載體安全性及DOX-SPB細(xì)胞毒性。采用流式細(xì)胞儀、激光共聚焦顯微鏡和Western blot，分別考察功能化SWCNTs的細(xì)胞攝取、細(xì)胞內(nèi)共定位、溶酶體逃逸、基因沉默和細(xì)胞凋亡。以A549荷瘤裸鼠為模型，采用小動(dòng)物活體成像儀觀察BR2修飾的功能化SWCNTs在裸鼠體內(nèi)的靶向性和分布情況。考察負(fù)載survivin siRNA與DOX的功能化SWCNTs在荷瘤裸鼠體內(nèi)的抗腫瘤效果。最后，

5、通過H&E染色法考察功能化SWCNTs對組織器官的影響。
　　結(jié)果：通過一系列合成及表征，DOX-SPBB-siRNA靶向納米載體成功構(gòu)建。在A549細(xì)胞中，BR2的靶向性明顯高于 RGD。載體的安全性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SPB對A549和293T細(xì)胞的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于SP。DOX-SPBB的IC50=63.5μg/mL。在對siRNA的轉(zhuǎn)染試驗(yàn)考察中，SPBB的轉(zhuǎn)染效率明顯高于SP和SPB；DOX-SPBB-siRNA的轉(zhuǎn)染效率低于 SP

6、BB-siRNA約20％，而兩種載體對 DOX的攝取無顯著性差異。負(fù)載siRNA的 SPB溶酶體逃逸速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 SP。DOX-SPBB-siRNA共定位實(shí)驗(yàn)表明，siRNA和 DOX能有效地進(jìn)入 A549細(xì)胞的胞質(zhì)及細(xì)胞核中發(fā)揮作用。另外，與Lipofectamine2000相比，SPBB-siRNA能更好地下調(diào)survivin相關(guān)蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。荷瘤裸鼠體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)表明，與 SPBB-siRNA或 DOX-SPBB比較，DO