奶牛瓣胃上皮細(xì)胞對小肽的吸收機(jī)制及小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體1的特征研究.pdf

1、小肽是奶牛的重要氮源和牛奶中乳蛋白形成的重要前體物，并且能被胃腸道大量吸收。本研究圍繞奶牛瓣胃上皮細(xì)胞(Omasal epithelial cells，OEC)及小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體1（Peptide transporter1，PepT1），探索瓣胃及PepT1吸收小肽的機(jī)制。首先，成功建立了奶牛OEC體外培養(yǎng)模型;其次，研究了OEC對小肽攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)PepT1在奶牛OEC吸收小肽過程中發(fā)揮著重要作用;最后，比對分析了奶牛PepT1(

2、bovine PepT1，bPepT1)的結(jié)構(gòu)特征，并對其表達(dá)功能特征和分布規(guī)律進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果如下:
　　1.奶牛OEC體外培養(yǎng)模型的建立及其功能檢測
　　該部分旨在建立奶牛OEC體外培養(yǎng)模型。瓣胃組織取自4頭新生的中國荷斯坦?fàn)倥?，采?.5％胰蛋白酶連續(xù)消化分離得到游離細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)在含10％血清、10 ng/mL表皮生長因子、5μg/mL胰島素、100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、50μg/mL慶

3、大霉素和2.5μg/mL兩性霉素B的DMEM高糖培養(yǎng)基中，通過H&E組織染色發(fā)現(xiàn)瓣胃上皮層已完全被消化酶分離下來。利用酶差消化法和相差貼壁法對OEC進(jìn)行純化，純化后的OEC呈現(xiàn)典型的上皮細(xì)胞鋪路石狀形態(tài)特征，純度達(dá)90％以上。通過免疫熒光染色檢測到上皮細(xì)胞內(nèi)角蛋白CK18和PepT1的表達(dá)，通過反轉(zhuǎn)錄PCR方法在上皮細(xì)胞中檢測到存在PepT1的mRNA表達(dá)，通過掃描電鏡和透射電鏡觀察到上皮細(xì)胞表面存在微絨毛，并且在細(xì)胞間有橋粒、緊密連接

4、結(jié)構(gòu)、基底層折疊和張力細(xì)絲等典型上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，并存在極化現(xiàn)象;細(xì)胞具有典型的“S”型細(xì)胞增長曲線，且至少可傳至10代。通過對OEC攝取2.5 mM二肽glycylsarcosine（Gly-Sar，甘氨酸-肌氨酸）功能進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OEC可完整地?cái)z取Gly-Sar并呈現(xiàn)pH依賴性（最佳pH5.5-6.5）、時(shí)間依賴性（在10 min時(shí)達(dá)到飽和）、濃度依賴性和溫度依賴性;此外還發(fā)現(xiàn)Gly-Sar在濃度較低時(shí)(＜1.5 mM)，通

5、過PepT1載體途徑的轉(zhuǎn)運(yùn)量較大，說明低濃度小肽存在時(shí)PepT1更易發(fā)揮作用。另外，這種攝取可以被Met-Gly二肽競爭性的抑制，而不被游離氨基酸(Free amino acid，F(xiàn)AA)抑制。綜上所述，OEC體外培養(yǎng)模型已成功建立，并且PepT1在其攝取小肽過程中發(fā)揮著重要作用，所培養(yǎng)的OEC可以作為體外研究瓣胃小肽吸收功能的模型。
　　2.PepT1在奶牛OEC吸收二肽中的功能及影響因素
　　該部分旨在研究奶牛OEC對G

6、ly-Sar的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)及其影響因素，探討PepT1基因在OEC吸收小肽過程中發(fā)揮的作用。免疫熒光化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)鋪滿的OEC細(xì)胞層有緊密連接蛋白(ZO-1和閉合蛋白)的表達(dá)，尤其在細(xì)胞連接處表達(dá)量更多;檢測鋪于Transwell濾膜OEC細(xì)胞層的電阻值和滲透性發(fā)現(xiàn)細(xì)胞層的電阻值在一周時(shí)達(dá)到平臺(tái)期，熒光素鈉的滲透率為0.63％，顯著低于對照組(無細(xì)胞組，12％)，說明細(xì)胞層已緊密形成，可以進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)。通過控制孵育細(xì)胞的溫度、pH、時(shí)間、濃

7、度、二乙烯焦碳酸酯（DEPC）和競爭肽及LPS的存在與否等不同條件，檢測下室中的小肽量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OEC在37℃時(shí)的轉(zhuǎn)運(yùn)量顯著高于4℃(P＜0.05)，并具有pH依賴性，OEC對Gly-Sar的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)可以被PepT1的His殘基抑制劑DEPC顯著抑制(P＜0.05)，也可被其他競爭性二肽抑制(P＜0.05)，但不被FAA抑制;從上室轉(zhuǎn)運(yùn)到下室的小肽量為反方向的3倍，說明小肽轉(zhuǎn)運(yùn)存在方向性。另外，siRNA特異性的干擾OEC的PepT1

8、基因表達(dá)可顯著降低其對Gly-Sar的吸收(P＜0.05)，然而過表達(dá)OEC的PepT1可以顯著增加Gly-Sar的吸收(P＜0.05);此外結(jié)果還發(fā)現(xiàn)不同種類(Gly-Sar、Lys-Lys和Met-Lys)和不同濃度（0.25 mM、2.5 mM和10mM）的小肽可顯著提高OEC的PepT1蛋白表達(dá)量(P＜0.05)。此外，結(jié)果還發(fā)現(xiàn)LPS可以上調(diào)PepT1基因的表達(dá)，降低膜電阻，增加OEC對小肽的轉(zhuǎn)運(yùn)量;另外，通過對瘤胃上皮細(xì)胞層

9、與OEC細(xì)胞層的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)能力進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)瓣胃上皮的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)能力顯著高于瘤胃。綜上所述，PepT1基因可能在奶牛OEC吸收小肽過程中起著重要作用，并受LPS的影響。
　　3.奶牛PepT1的功能表達(dá)和分布規(guī)律
　　通過對克隆的全長奶牛bPepT1氨基酸序列與其他25個(gè)物種進(jìn)行序列比對和結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)bPepT1與其他物種PepT1的氨基酸序列具有較高的同源性，同源性由高到低依次為山羊(96.2％)、綿羊(95.2％)、馬

10、(85.9％)、豬(85.6％)、狗(83.4％)、人(83.0％)、鼠類(82％-83％)、猴類(81％-83％)、兔(78.6％)、禽類(64％)、魚類(56％-61％);奶牛bPepT1蛋白結(jié)構(gòu)中含有12個(gè)跨膜區(qū)、2個(gè)PKA位點(diǎn)、4個(gè)PKC位點(diǎn)和6個(gè)N連接糖基化位點(diǎn)，并且在跨膜區(qū)9和10間存在一個(gè)大胞外環(huán)。利用Western blot分析了奶牛bPepT1的胃腸道組織分布規(guī)律，發(fā)現(xiàn)空腸和回腸的bPepT1蛋白表達(dá)量顯著高于其他部位

11、（P＜0.05），表達(dá)量最低的部位為瘤胃，奶牛bPepT1蛋白表達(dá)量從高到低依次為:空腸＞回腸＞十二指腸＞瓣胃＞瘤胃，說明奶?？漳c和回腸可能具有較前胃更強(qiáng)的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)能力。另外，將真核表達(dá)載體pcDNA3.1/bPepT1轉(zhuǎn)染到中國倉鼠卵母(CHO)細(xì)胞內(nèi)，并成功表達(dá)了bPepT1基因和功能，轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞對0.02 mM同位素標(biāo)記的[3H]-Gly-Sar的攝取在10min時(shí)達(dá)到飽和，并存在pH依賴性，最佳攝取pH為6.5-7.0(p

12、H梯度為:5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5);存在濃度依賴性（濃度梯度為:0.02-10 mM），米氏常數(shù)Km(代表親和力)為0.94±0.06 mM，最大轉(zhuǎn)運(yùn)速率Vmax為20.80±1.74 nmol/(mg protein·5 min)，屬于低親和力高容量載體。通過檢測其他16種含Met和Lys等EAA的小肽的IC50(抑制[3H]-Gly-Sar吸收量一半時(shí)所需要抑制肽的濃度，IC50越大表示親和力越小)，發(fā)現(xiàn)bP

13、epT1對不同小肽的親和力不同，其中11種小肽的IC50在0.014-0.096 mM之間(Trp-Phe、Met-Lys、Met-Glu、Gly-Met、Lys-Met、Met-Gly、Gly-Lys、Met-Leu、Lys-Phe、Met-Met和Met-Leu-Phe），說明bPepT1對這些小肽有很高的親和力;另外4種小肽（Lys-Lys、Leu-Gly-Gly、Lys-Trp-Lys和Met-Gly-Met-Met）的IC50

14、大于2.069mM，說明它們不易被bPepT1轉(zhuǎn)運(yùn)，其中Lys-Lys幾乎不被轉(zhuǎn)運(yùn)(IC50大于10mM);此外，在FAA存在時(shí)并沒有抑制現(xiàn)象。總之，本試驗(yàn)是初次系統(tǒng)研究奶牛bPepT1的表達(dá)功能特點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)bPepT1可廣泛轉(zhuǎn)運(yùn)二肽和三肽，對C端含Lys的肽、含正電荷的肽、長鏈肽不易轉(zhuǎn)運(yùn)，并具有種屬特異性。
　　綜上所述，本文成功建立了體外研究奶牛小肽吸收的OEC培養(yǎng)模型，發(fā)現(xiàn)bPepT1在OEC吸收小肽過程中發(fā)揮了重要作用，并