大豆疫霉定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的分析和PsMPK7功能分析及互作蛋白的篩選.pdf

1、大豆疫霉（Phytophthora sojae）是植物病原卵菌的代表性物種之一，它引起的根腐病是大豆生產(chǎn)上的毀滅性病害之一，每年給全球大豆生產(chǎn)造成上幾十億美元的經(jīng)濟(jì)損失。大豆疫霉雖然在菌絲形狀上與低等真菌相似，但在進(jìn)化關(guān)系上卻與真菌相差甚遠(yuǎn)，在致病機(jī)制上與真菌存在很大差異。因此，研究疫霉菌相對(duì)獨(dú)特的致病分子機(jī)制，將有利于設(shè)計(jì)與開發(fā)特異的作物疫病防控藥劑。
　　由于疫霉菌的遺傳操作較為困難，利用傳統(tǒng)的功能基因的研究方法耗時(shí)耗力、成本

2、高、效率低。因此我們借助高通量的蛋白組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，來幫助我們提高鑒定重要基因的效率。本研究首先對(duì)大豆疫霉菌絲階段、孢子囊階段以及菌絲侵染大豆階段進(jìn)行了磷酸化蛋白組的測(cè)定，獲得了許多在孢子囊階段或侵染階段被磷酸化的蛋白質(zhì)。在此基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)大豆疫霉中的一個(gè)在菌絲階段、侵染階段以及孢子囊階段都能被磷酸化的MAPK蛋白，即PsMPK7。為了研究該基因的功能，首先對(duì)該基因的模型進(jìn)行校正后，對(duì)PsMPK7進(jìn)行基因沉默，發(fā)現(xiàn)了該基因不僅參與大豆

3、疫霉的致病力、有性生殖以及對(duì)外界脅迫的應(yīng)答之外，而且影響了胞外的漆酶活性。用酵母雙雜交與親和純化的方法對(duì)其互作蛋白進(jìn)行了篩選與驗(yàn)證。本文主要內(nèi)容如下:
　　大豆疫霉菌絲、孢子囊以及侵染大豆階段的定量磷酸化組數(shù)據(jù)分析:對(duì)本次定量磷酸化蛋白組數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)，侵染階段共鑒定到4577個(gè)磷酸化位點(diǎn)，孢子囊階段共鑒定到3353個(gè)磷酸化位點(diǎn)。在菌絲階段與侵染階段的混合樣品中共檢測(cè)到42個(gè)效應(yīng)分子（包括28個(gè)RxLR，5個(gè)NLP，7個(gè)CRN和2

4、個(gè)elicitin類效應(yīng)分子），同時(shí)鑒定到14個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、20個(gè)轉(zhuǎn)錄因子以及107個(gè)蛋白激酶等被磷酸化。在菌絲階段和孢子囊階段的混合樣品中鑒定到16個(gè)效應(yīng)分子（1個(gè)NLP和15個(gè)RxLR類效應(yīng)分子）、9個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、15個(gè)轉(zhuǎn)錄因子以及47個(gè)蛋白激酶被磷酸化。對(duì)其磷酸化水平進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，侵染階段、孢子囊階段的菌絲與菌絲階段相比，有的蛋白磷酸化的水平發(fā)生了變化，有的并未變化，還有的蛋白只在混合樣品中的一個(gè)階段被磷酸化，而無法對(duì)其

5、磷酸化水平進(jìn)行定量。本研究率先對(duì)大豆疫霉被磷酸化的蛋白進(jìn)行了定量磷酸化組鑒定，結(jié)果為研究植物病原卵菌與寄主的互作提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　PsMPK7的功能分析及互作蛋白的篩選:在定量磷酸化蛋白質(zhì)組中，檢測(cè)到了PsMPK7在菌絲階段、孢子囊階段和侵染階段都被磷酸化。PsMPK7在轉(zhuǎn)錄組中顯示在游動(dòng)孢子，休止胞以及休止胞萌發(fā)階段均上調(diào)表達(dá)。將PsMPK7的基因模型校正清楚之后，利用基因沉默的方法對(duì)PsMPK7的功能進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P

6、sMPK7沉默后致病力減弱，卵孢子產(chǎn)量下降，而且突變體影響了菌株對(duì)外界脅迫的耐受性。本研究我們發(fā)現(xiàn)該基因的沉默也影響了漆酶的活性。我們用酵母雙雜交的方法分別驗(yàn)證了4個(gè)MEK與PsMPK7激酶區(qū)域的互作，發(fā)現(xiàn)彼此都不互作。但這并不意味著它們真的就不互作，產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能有:1.大豆疫霉中MEK與MAPK的磷酸化互作只是瞬時(shí)的，用酵母雙雜交這種體系不適合驗(yàn)證它們之間短暫瞬時(shí)的互作;2.大豆疫霉的MAPK和MEK之間不存在直接互作關(guān)系，