腺相關病毒介導IL-10轉基因治療對兔自身免疫淚腺炎干眼模型免疫抑制作用.pdf

1、目的：淚腺功能異常是干眼的主要原因，而自身免疫淚腺炎如Sjogren’s綜合癥是淚液分泌不足的常見原因。本研究的目的是探討兔淚腺上皮細胞激活自體外周血淋巴細胞，誘導兔自身免疫干眼模型，并對臨床體征和組織病理變化進行評估；采用四環(huán)素基因表達調控系統(tǒng)(Tet系統(tǒng))調控的AAV載體介導IL-10轉基因治療，觀察IL-10在淚腺和眼表的表達時間及變化，評估IL-10對淚腺免疫病理和眼表體征的作用。
　　 方法：
　　 1.結合濾

2、膜分離和密度梯度離心法分離提純兔淚腺上皮細胞(pLGEC)，對分離細胞的活性、純度、形態(tài)特征進行鑒定。分離的pLGEC體外培養(yǎng)2d后gamma射線照射，與等量(105細胞/孔，96孔板)自體外周血淋巴細胞(PBL)混合培養(yǎng)5d。[3H]-thymidine摻入法鑒定PBL增殖率。對培養(yǎng)前及培養(yǎng)后PBL行細胞表面抗T細胞、B細胞、CD4和CD8單克隆抗體染色和FACS分析。
　　 2.新西蘭白兔左眼下淚腺切除，分離淚腺上皮細胞體外

3、培養(yǎng)2d，gamma線照射，與體外獨立培養(yǎng)2d的自體PBL混合培養(yǎng)5d，[3H]-thymidine摻入法測定PBL激活情況。自平行培養(yǎng)的混合細胞內分離激活的PBL，用于自體過繼轉移動物模型制備。[3H]-thymidine摻入實驗測定激活指數(shù)大于2者將分離的PBL經耳靜脈注射回供體兔誘發(fā)自身免疫干眼病(ID/IV)。致病組一組注射后4周處死(ID/IV4，n=9)，另一組注射后8周處死(ID/IV8，n=6)。陰性對照組(n=8)摘除

4、左眼下淚腺，耳靜脈注射未經混合培養(yǎng)的自體外周血淋巴細胞(未激活)。未經任何處理的正常兔作為正常對照組(n=4)。注射前及注射后每2周雙眼眼表臨床檢查，包括Schirmer I實驗、BUT和rose Bengal染色。處死后收集兔上、下淚腺，結膜和唾液腺進行組織病理H&E染色和免疫組化染色。
　　 3.與淚腺上皮細胞混合培養(yǎng)激活的自體外周血淋巴細胞注射回供體兔誘發(fā)自身免疫性淚腺炎(n=16)。注射后4周，一組下淚腺注射AAV2-t

5、etON-vIL-10(1x108 pfu/200 L)轉基因治療(ID/Rx，n=8)；未注射組作為對照組(ID，n=8)，兩組兔每日飲用水內均加入強力霉素(200 mg/kg)，誘導vIL-10表達。致病后16周(轉基因治療后12周)處死兔取淚腺進行病理和免疫組化分析。
　　 結果：
　　 1.光學顯微鏡鏡檢顯示分離的細胞主要為直徑為16 um的單個腺泡細胞或3-20個細胞組成的細胞團，培養(yǎng)4天時細胞聚集成腺泡樣細胞

6、團。PBL-pLGEC混合細胞培養(yǎng)組[3H]-thymidine摻入增殖指數(shù)是單獨PBL組或照射后pLGEC組的5-8倍；FACS分析顯示與未激活的單獨培養(yǎng)的外周血淋巴細胞群相比，被自體淚腺上皮細胞激活后的外周血淋巴細胞內T細胞數(shù)含量增加了約2倍。在激活前外周血CD4+T細胞占T細胞的20％，而激活后增高到70％。CD8+T細胞在激活反應前及激活反應后含量無明顯改變。B細胞的含量在激活前后也保持不變或減少。
　　 2.與正常組相

7、比，靜脈注射致病后4周淚液分泌減少50％，淚膜破裂時間縮短70％。Rose Bengal染色顯示眼表上皮缺損，但與直接淚腺注射致病組比較程度減輕。靜脈注射后4周淚腺內腺管周圍和小血管周圍頻繁可見以CD+T細胞為主的大的淋巴細胞浸潤灶；同時可見淋巴流動樣浸潤區(qū)。注射后8周淚腺病理改變較4周加重，顎下腺腺葉內也可見大面積的腺泡變性區(qū)和淋巴流動樣浸潤灶。
　　 3.ID/Rx組臨床體征較ID組總體明顯改善。組織病理檢查顯示ID組可見散

8、在大的淋巴細胞浸潤灶和腺泡變性或萎縮，而ID/Rx組淋巴浸潤灶減少、變小。與ID組相比，ID/Rx組淚腺內CD18+細胞增加5倍之多，CD4：CD8比率減少16倍，而RTLA+細胞數(shù)兩組間無差異。
　　 結論：
　　 1.結合濾膜分離和密度梯度離心法可獲得較高純度的淚腺上皮細胞，培養(yǎng)、照射后可成功激活自體外周血淋巴細胞。
　　 2.被淚腺抗原激活的淋巴細胞經耳靜脈注射回供體兔可歸巢到淚腺和顎下腺并促發(fā)自身免疫過程

9、，說明這些部位本質上包含抗原提呈細胞，這些細胞表達致病性自身抗原表位；同時還含有招募CD4+T細胞的化學因子和淋巴細胞歸巢分子。這種經耳靜脈途徑制備的兔干眼模型，由于顎下腺和淚腺同時受累，更逼真的模擬了Sjogren’s綜合征。該模型更適用于闡明Sjogren’s發(fā)病機理和病理生理的研究，同時也是評估治療方法的理想實驗模型。
　　 3.AAV介導的vIL-10轉基因治療可改善實驗性自身免疫淚腺炎的臨床體征和病理變化。通過免疫組織