嵌合狀態(tài)對大鼠肺移植慢性排斥產(chǎn)生免疫抑制作用的實驗研究.pdf

1、肺移植是終末期肺病唯一有效的治療方法。盡管目前肺移植的術(shù)后一年生存率可達(dá)71％，約46％的患者術(shù)后生存期可超過5年，但真正限制肺移植患者長期生存的原因仍然是移植術(shù)后的慢性排異，其最終結(jié)果即閉塞性細(xì)支氣管炎(ObliteransBronchiolitis，OB)的發(fā)生。國外的大宗資料統(tǒng)計表明，在生存期超過3月的病人中，有28％以上的患者存在著不同程度的OB；移植術(shù)后第一年OB發(fā)生率為50％。更長期的隨訪資料提示，在肺移植術(shù)后5到10年后，

2、OB的發(fā)生率將高達(dá)60-80％。它不單可以直接導(dǎo)致死亡，同時也可以通過繼發(fā)感染、以及相關(guān)治療所引起的各類不良反應(yīng)等間接導(dǎo)致患者死亡。匹茲堡醫(yī)學(xué)中心的經(jīng)驗認(rèn)為近25-40％的患者直接或者間接病死于OB。
　　 目前預(yù)防和治療移植后排斥反應(yīng)的主要手段是應(yīng)用免疫抑制藥物。這些藥物除需終生服用外，其毒副作用也非常明顯，且價格昂貴，部分患者甚至因藥物的毒副作用或經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)被迫停藥；同時此類免疫抑制治療OB的方法往往療效不理想，嚴(yán)重影響移植患

3、者的長期存活。因此，研究免疫抑制或耐受的有效方法，對預(yù)防和治療慢性排異的發(fā)生、進(jìn)一步延長移植物存活具有至關(guān)重要的意義。
　　 近年來隨著研究的不斷深入，臨床免疫學(xué)家發(fā)現(xiàn)器官移植后通過向受體移植供體造血干細(xì)胞或骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BM-MSCs)建立混合嵌合體，對免疫耐受的誘導(dǎo)有幫助。這一理論的提出解決了困繞移植學(xué)者多年的免疫排斥難題，成為目前移植領(lǐng)域研究的新前沿。

4、
　　 BM-MSCs是成體干細(xì)胞的一種，存在于骨髓中，具有干細(xì)胞的共性和很強(qiáng)的自我增殖能力及多向分化潛能，能表達(dá)多種表面抗原和分泌多種細(xì)胞因子，是一種較原始的骨髓基質(zhì)細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)非清髓處理后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bonemarrowmesenchymalstemcells，BM-MSCs)輸注受體后，髓系樹突狀細(xì)胞(DC)會定向遷移至胸腺并向T細(xì)胞提供陰性選擇信號，有可能產(chǎn)生外周免疫耐受，這為抑制慢性排異提供了可能。

5、　　 綜上所述，我們構(gòu)想將骨髓細(xì)胞移植用于誘導(dǎo)受體嵌合，并進(jìn)一步誘導(dǎo)肺移植慢性排異的免疫抑制或免疫耐受，并對肺移植慢性排異的機(jī)理進(jìn)行探討。
　　 1、實驗分兩組：實驗組（I組）采用10只SD大鼠為供體，10只Wistar大鼠為受體；對照組（II組）10只供體、受體均采用SD大鼠。均行異位氣管移植。術(shù)后3，14，28天，處死大鼠，取出移植物。鏡下觀察：氣道閉塞情況；氣道上皮完整性；氣道粘膜下炎細(xì)胞浸潤、纖維組織增生的情況。

6、>　　 2、實驗分7組(n=10)：A組：在既定實驗日早晨全身輻照。然后經(jīng)全身輻照大鼠于2天后給予腹腔內(nèi)注射CTX(50mg/kg)一次，7天后直接行大鼠氣管異位移植，移植后4h內(nèi)經(jīng)尾靜脈輸注生理鹽水0.8mL。B組：在既定實驗日早晨全身輻照。然后經(jīng)全身輻照大鼠于2天后給予腹腔內(nèi)注射CTX(50mg/kg)—次。7天后直接行大鼠氣管異位移植，移植后4h內(nèi)經(jīng)大鼠尾靜脈輸注濃度為2×108/mlSD大鼠骨髓細(xì)胞(BMC)的細(xì)胞懸液0.8m

7、l。C組：在既定實驗日早晨全身輻照。然后經(jīng)全身輻照大鼠于2天后給予腹腔內(nèi)注射CTX(50mg/kg)一次。7天后直接行大鼠氣管異位移植，移植后4h內(nèi)經(jīng)大鼠尾靜脈輸注濃度為2×108/mlSD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)的細(xì)胞懸液0.8ml。D組：移植前5天開始給予腹腔內(nèi)注射CTX(50mg/kg)一次，移植前2天大劑量FK506腹腔注射，3mg×2d；術(shù)前一天受體Wistar大鼠腹腔內(nèi)注射抗淋巴細(xì)胞血清1ml。2天后直接行大鼠

8、氣管異位移植，移植后4h內(nèi)經(jīng)尾靜脈輸注生理鹽水0.8mL。移植當(dāng)天起至術(shù)后第6天每天腹腔注射FK5060.5mg/kg/d。E組：移植前5天開始給予腹腔內(nèi)注射CTX(50mg/kg)一次，移植前2天大劑量FK506腹腔注射，3mg×2d；術(shù)前一天受體Wistar大鼠腹腔內(nèi)注射抗淋巴細(xì)胞血清1ml。2天后直接行大鼠氣管異位移植，移植后4h內(nèi)經(jīng)大鼠尾靜脈輸注濃度為2×108/mlSD大鼠骨髓細(xì)胞(BMC)的細(xì)胞懸液0.8ml。移植當(dāng)天起至術(shù)

9、后第6天每天腹腔注射FK5060.5mg/kg/d。F組：移植前5天開始給予腹腔內(nèi)注射CTX(50mg/kg)一次，移植前2天大劑量FK506腹腔注射，3mg×2d；術(shù)前一天受體Wistar大鼠腹腔內(nèi)注射抗淋巴細(xì)胞血清1ml。2天后直接行大鼠氣管異位移植，移植后4h內(nèi)經(jīng)大鼠尾靜脈輸注濃度為2×108/mlSD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)的細(xì)胞懸液0.8ml。移植當(dāng)天起至術(shù)后第6天每天腹腔注射FK5060.5mg/kg/d。G組

10、：移植前5天開始給予腹腔內(nèi)注射CTX(50mg/kg)一次，移植前2天大劑量FK506腹腔注射，3mg×2d；術(shù)前一天受體Wistar大鼠腹腔內(nèi)注射抗淋巴細(xì)胞血清1ml。2天后直接行大鼠氣管異位移植，移植后4h內(nèi)經(jīng)大鼠尾靜脈輸注濃度為2×108/mlSD大鼠骨髓細(xì)胞(BMC)的細(xì)胞懸液0.8ml。移植當(dāng)天起至術(shù)后第6天每天腹腔注射FK5060.5mg/kg/d。移植后6天經(jīng)大鼠尾靜脈輸注濃度為2×108/mlSD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(B

11、M-MSCs)的細(xì)胞懸液0.8ml。隨后測定異基因嵌合體量的變化及單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的刺激效應(yīng)，流式細(xì)胞儀檢測了T淋巴細(xì)胞亞群的變化，檢測細(xì)胞移植后受體內(nèi)IL-2、IL-IO細(xì)胞因子的表達(dá)和氣管的阻塞率。檢測移植物病理組織學(xué)，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 1、兩組移植氣管及支氣管的閉塞性細(xì)支氣管炎發(fā)生率實驗組閉塞性細(xì)支氣管炎的發(fā)生率為100％，對照組未發(fā)生閉塞。對照組與實驗組移植氣管及支氣管閉塞性細(xì)支氣管炎發(fā)生率差異具有顯著性意義

12、
　　 2、B、C組動物接受60Coγ射線全身照射經(jīng)環(huán)磷酰胺預(yù)處理后行BMC/BM-MSCs移植，E、F組動物接受FK506腹腔注射后行BMC/BM-MSCs移植，在外周血、脾臟中均檢測到嵌合的存在。輸注BMC組較BM-MSCs組嵌合體水平維持更久。A、D組動物未接受BMC/BM-MSCs移植的未檢測到嵌合。但嵌合體模型隨著時間推移，其嵌合會漸漸消失。
　　 3、于氣管移植后21天后取雌性Wistar大鼠脾淋巴細(xì)胞作為效

13、應(yīng)細(xì)胞，用雄性SD脾淋巴細(xì)胞經(jīng)絲裂霉素處理后作為刺激細(xì)胞將兩者行單向混合細(xì)胞培養(yǎng)，A、B、C、D、E、F、G組與O組相比均呈增殖反應(yīng)。計算刺激效應(yīng)結(jié)果顯示：C組較B組和A組的受體淋巴細(xì)胞增殖顯著減弱(P<0.05)；B組較A組也顯著減弱(P<0.05)。G組較D、E、F組的受體淋巴細(xì)胞增殖顯著減弱(P<0.05)；F組較E組也顯著減弱(P<0.05)，E、F組較同期B、C組無明顯差異。
　　 4、大鼠接受5Gy全身照射后外周淋巴

14、細(xì)胞于照后一周左右降至最低水平，經(jīng)輻照后白細(xì)胞中T細(xì)胞亞群CD3+細(xì)胞比例急劇減低降至5％左右，但各處理組中CD3+細(xì)胞中CD4+、CD8+含量比值并無大的變化，只是與正常大鼠相比CD4+有所降低，而CD8+的含量稍有上升。
　　 5、受體IL-2水平在無處理組（A、D組）氣管移植后28天時較移植前明顯升高(P<0.05)，而在實驗組（B、C、E、F、G組）移植術(shù)后IL-2水平較移植前也有升高，與A、D組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0

15、.05)。無處理組受體IL-10水平在移植后28天時較移植前無明顯差別(P>0.05)，實驗組（B、C、E、F、G組）在移植后28天時明顯升高，與A組、D組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。E、F組較同期B、C組無明顯差異。
　　 6、BMC移植組和BM-MSCs移植組氣管移植后28天阻塞率較對照組減低。移植后28天阻塞率E、F組較同期B、C組減低。
　　 7、A、D組氣管纖毛比例遠(yuǎn)低于正常氣管和G組(P<0.01)，G

16、組氣管和正常氣管相比無統(tǒng)計學(xué)意義。B組和E組相比無統(tǒng)計學(xué)意義，C組和F組相比無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 8、于術(shù)后28天分批處死動物，在對照組標(biāo)本中可以觀察到嚴(yán)重的結(jié)締組織包裹。在低倍鏡下觀察，對照組標(biāo)本的氣管管腔內(nèi)有肉芽組織向管腔內(nèi)增生，造成管腔閉塞。鏡下觀察可見對照組組在術(shù)后28天移植氣管內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤，上皮層有壞死、脫落，可見有大量肉芽組織向管腔內(nèi)生長，氣管管腔幾乎完全閉塞。而在使用BMC/BM-MSCs干預(yù)下，上述情況有

17、所改善。見管腔通暢，上皮細(xì)胞少量壞死、脫落，覆蓋于移植氣管內(nèi)壁，氣管壁內(nèi)可見少量炎細(xì)胞浸潤。但B、C、E、F、G各組差別不明顯。
　　 1．大鼠氣管異位移植模擬肺移植慢性排斥反應(yīng)。
　　 2．新型的非破壞骨髓的預(yù)處理與傳統(tǒng)的照射等非清髓性預(yù)處理方式比較同樣誘導(dǎo)出了嵌合，并且在抑制慢性排斥反應(yīng)方面同樣有效。
　　 3．通過在非清髓性預(yù)處理后輸注供體骨髓細(xì)胞或骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，可以建立混合嵌合體，調(diào)節(jié)Th1/Th2型