兔自身免疫性干眼模型制作及檢測

1、兔自身免疫性干眼模型制作及檢測,兔自身免疫性干眼模型,概要通過體外分離、培養(yǎng)兔淚腺上皮細(xì)胞和自體外周血淋巴細(xì)胞，建立二者的共培養(yǎng)體系。將體外激活的自體外周血淋巴細(xì)胞通過耳緣靜脈注射的方法誘發(fā)自身免疫性淚腺炎。從而建立穩(wěn)定的兔自身免疫性干眼模型，對干眼臨床指標(biāo)及淚腺細(xì)胞因子表達(dá)進(jìn)行檢測。,兔自身免疫性干眼模型,實(shí)驗(yàn)動物 ：成年雌性新西蘭白兔，體質(zhì)量2.6～3.5kg。實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行兔子臨床眼科檢查, 排除已患有眼部炎癥和其他疾病的動物

2、，建立正常兔眼的臨床檢查指標(biāo)的基線水平。飼養(yǎng)環(huán)境符合醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物環(huán)境的要求，動物飼養(yǎng)房溫度為 25±2℃，相對濕度 50%～75%，12 小時光照晝夜循環(huán)，通風(fēng)狀況好。,兔自身免疫性干眼模型,實(shí)驗(yàn)所用的主要儀器、設(shè)備及材料 ：,生物超凈工作臺CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱移液槍-80℃超低溫冰箱倒置相差顯微鏡臺式離心機(jī)裂隙燈顯微鏡攝像系統(tǒng)離心管、槍頭PCR儀實(shí)時定量PCR儀流式細(xì)胞儀流式管超純水裝置,低溫水箱

3、裂隙燈顯微鏡恒溫水浴鍋眼科手術(shù)器械禍旋儀高壓蒸汽消毒器電子天平鼓風(fēng)式干燥箱磁力攪拌器PH測量計熒光顯微鏡SY-600恒溫水箱Nylon細(xì)胞濾網(wǎng),兔自身免疫性干眼模型,主要試劑及溶液配制 ：淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基（CM）RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基 450ml胎牛血清（FBS） 10%青鏈霉素

4、 100U/mlL-谷氨酰胺 2mM2-mercaptoethano 0.5ml淚腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）DMEM（1X high glucose） 450ml胎牛血清（FBS） 10%青鏈霉素

5、 100U/mlL-谷氨酰胺 2mM,兔自身免疫性干眼模型,主要試劑及溶液配制 ：Ham's液Ham's F-12 1LHepes 10ml/L牛血清蛋白蛋白（BSA）

6、 100U/ml胰蛋白酶抑制劑 50mg/L丁酸 0.22g/L青鏈霉素 100U/mlL-谷氨酰胺 2mM亞油酸

7、 1mg/ml 42ul各組分充分溶解于900ml Ham’s F-12后調(diào)節(jié)PH值至7.4，Ham’s F-12定容至1000ml，0.22μm 濾器過濾，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?兔自身免疫性干眼模型,主要試劑及溶液配制 ：Hank's液Hanks Salts 1bottleHepes

8、 2.38gEDTA 0.76g各組分充分溶解于900ml 超純水后調(diào)節(jié)PH值至7.4，超純水定容至 1000mL，0.22μm 濾器過濾，4℃冰箱避光保存?；旌舷福–DH）膠原酶 collagenaseⅠ 450unit/ml透明質(zhì)酸酶 hyyalur

9、onidase 200unit/mlDNA酶Ⅰ 25unit/ml分別稱取計算好的Ⅰ型膠原酶和透明質(zhì)酸酶，將其充分溶解于一定體積的 Ham’s液中，加入溶解分裝好的 DNA 酶充分混勻，0.22μm 濾器過濾，4℃冰箱備用。,兔自身免疫性干眼模型,主要試劑及溶液配制 ：10% FicollFicoll 粉與 DPBS 按比例配制高壓滅菌, 分裝后-2

10、0'C 避光保存。實(shí)時突光定量 PCR 試劑盒 SYBR Green (Roche 491385001)PE-Anti-Human Foxp3 (Biolegend)Anti-Rabbit CD4(Mouse anti-Rabbit Monoclonal AntibodyAbD )淋巴細(xì)胞分離液 無 RNA 酶水（DEPC 水）,兔自身免疫性干眼模型,實(shí)驗(yàn)方法 ：1、兔淚腺上皮細(xì)胞分離、純化、培養(yǎng)（1）新西蘭大白兔

11、肌肉注射陸眠寧和氯胺酮（兩者的比例為2:3，0.3-0.4ml/kg）進(jìn)行麻醉，剪去兔左眼睫毛，將生理鹽水和碘伏按1:1稀釋，充分清洗術(shù)眼結(jié)膜囊，再用生理鹽水清洗，以免碘伏刺激眼表，后用0.5%鹽酸丁卡因滴眼液滴術(shù)眼，后用無菌手術(shù)器械將麻醉后的兔子在超凈臺中操作摘取兔左下淚腺, 將淚腺轉(zhuǎn)移到提前配置好的裝有雙抗和Ham’s液的50ml離心管中。（2）在細(xì)胞間超凈臺進(jìn)行以下操作，將淚腺和少量的Ham’s液放入培養(yǎng)皿中，先剔除淚腺組織周圍

12、的血管、脂肪組織和筋膜，無菌刀將腺體切碎至約1mm×1mm的組織塊，用移液槍加入Hank’s液后吹打吹散組織塊，轉(zhuǎn)移到50ml離心管中傾斜靜置15min，棄掉上清。（3）然后再加入Ham’s液吹打均勻傾斜靜置15min，小心棄掉上清，以防組織塊的丟失。（4）加入配置好的消化酶（膠原酶，透明質(zhì)酸酶，DNA酶）,磁力攪拌器提前設(shè)置好溫度和轉(zhuǎn)速，37℃恒溫水浴消化10min。,兔自身免疫性干眼模型,實(shí)驗(yàn)方法 ：1、兔淚腺上皮細(xì)

13、胞分離、純化、培養(yǎng)（5）取出后靜置15min，棄掉上清，加入10ml Hank’s液反復(fù)吹打后靜置15min，棄掉上清。（6）再加入配置好剩余的消化酶，37℃水浴消化30min，觀察組織塊的大小，可適當(dāng)?shù)脑鰷p10min。（7）然后用Ham’s液浸潤40μm無菌細(xì)胞篩，將其置于50ml離心管上，將稀釋后的混合液吹打均勻后過濾，1000rpm離心6min，棄上清。（8）加入20ml Hank’s液吹打均勻，離心1000rpm，6mi

14、n，棄上清，加入5ml Ham’s液充分混勻。（9）提前準(zhǔn)備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Ficoll（Sigma Ficoll粉與 Ham’s液配制），用Ham’s液稀釋到2%、3%、4%，從下到上依次為4%、3%、2%各5ml加入50ml離心管中，將細(xì)胞懸液緩慢加入到Ficoll液面上，進(jìn)行密度梯度離心，400 rpm離心10min，上下加速度為0。,兔自身免疫性干眼模型,實(shí)驗(yàn)方法 ：1、兔淚腺上皮細(xì)胞分離、純化、培養(yǎng)（10）離心后，細(xì)胞

15、在最底層。棄上清，用PBS緩沖液洗兩遍細(xì)胞，洗掉雜質(zhì)和Ficoll，離心結(jié)束盡可能棄干凈上清。（11）加入DMEM完全培養(yǎng)基（10%FBS+1%雙抗+1%谷氨酰胺+DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基），進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)和細(xì)胞活性觀察，細(xì)胞計數(shù)后取一定數(shù)量105細(xì)胞于100μL PBS內(nèi)吹打均勻，再加入100μL的臺盼藍(lán)，顯微鏡下觀察計數(shù)板上細(xì)胞染色情況，計錄未著染的細(xì)胞百分比。（12）將分離的淚腺上皮細(xì)胞1.5×105/孔放置24孔板中于37

16、℃、5% CO2、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。,兔自身免疫性干眼模型,實(shí)驗(yàn)方法 ：2、兔外周血淋巴細(xì)胞分離、培養(yǎng)（1）將新西蘭大白兔固定，兔耳中動脈碘伏消毒后用酒精棉球擦拭使其血管擴(kuò)張，用提前準(zhǔn)備的靜脈采血針和采血管采血，每只兔預(yù)計抽大約20mL的外周血。（2）用提前預(yù)熱的37℃的PBS緩沖液將外周血稀釋3倍后裝在50mL離心管中（每管約30ml）。（3）將每管約30ml稀釋的外周血緩慢加入到10mL淋巴細(xì)胞分離液液面上，離

17、心2000 rpm，20min，上下加速度為0。（4）離心后可見離心管中分三層，在上、中間層界面處有一以淋巴細(xì)胞為主的白色云霧狀狹窄帶，這一層細(xì)胞即為所需要，吸取收集該層淋巴細(xì)胞帶放入新的50mL離心管中。（5）加入PBS緩沖液，離心2000 rpm，10min, 棄上清，再加入PBS緩沖液離心。,兔自身免疫性干眼模型,實(shí)驗(yàn)方法 ：2、兔外周血淋巴細(xì)胞分離、培養(yǎng)（6）加淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基（10%FBS+1%雙抗+1%谷氨酰胺+RPM

18、I1640培養(yǎng)基+β巰基乙醇），計數(shù)，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)和細(xì)胞活性觀察，細(xì)胞計數(shù)后取一定數(shù)量105細(xì)胞于100μLPBS內(nèi)吹打均勻，再加入100μL的臺盼藍(lán)，計錄未著染的細(xì)胞百分比。（7）分別配制與淚腺上皮細(xì)胞等密度的細(xì)胞液。,兔自身免疫性干眼模型,實(shí)驗(yàn)方法 ：3、建立自體細(xì)胞混合培養(yǎng)體系淚腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)于平底24孔板內(nèi)（1.5x105個/孔），單獨(dú)培養(yǎng)2d的淚腺上皮細(xì)胞，進(jìn)行γ線照射（劑量為25Gy），使其失去反應(yīng)能力，成為刺激細(xì)胞。

19、載有淚腺上皮細(xì)胞的24孔板照完射線后，每孔加入當(dāng)天分離等數(shù)量的外周血淋巴細(xì)胞1.5×105個，此時淚腺上皮細(xì)胞已貼壁，淋巴細(xì)胞為懸浮細(xì)胞，加入淋巴細(xì)胞時候小心緩慢加入，以防吹起已貼壁的淚腺上皮細(xì)胞，建立混合培養(yǎng)體系，培養(yǎng)5天。,兔自身免疫性干眼模型,實(shí)驗(yàn)方法 ：4、自身免疫干眼模型的制備（1）實(shí)驗(yàn)分組：24只術(shù)前檢查合格的雌性新西蘭大白兔，按照隨機(jī)數(shù)表法給兔子編號，分為2組即正常對照組，干眼模型組。干眼模型組為靜脈回輸自

20、體激活的外周血淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)的兔自身免疫性干眼。正常對照組為靜脈回輸與干眼模型組等體積的PBS緩沖液。（2）干眼模型的制備：將標(biāo)注好的雌性新西蘭白兔固定，預(yù)先準(zhǔn)備好輸液器、5ml、10ml針管、酒精、碘伏，以及預(yù)先準(zhǔn)備好的淋巴細(xì)胞（混合體系混合培養(yǎng)5天，觀察發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞較之前體積變大，呈圓形，聚集性分布，周圍可見圍繞的淚腺上皮細(xì)胞，用1ml槍頭緩慢吹起落在底部的淋巴細(xì)胞，收集到50ml離心管中，在這個過程中在顯微鏡下觀察進(jìn)來避免吹起貼壁

21、的淚腺上皮細(xì)胞，用PBS緩沖液將24孔板洗兩遍，2000rpm離心10min，棄掉上清，再用PBS緩沖液洗一遍，之后加1ml的PBS緩沖液計數(shù)，吹散細(xì)胞，盡可能不要有細(xì)胞團(tuán)塊避免栓塞發(fā)生的可能，最后按照淋巴細(xì)胞2×105每只兔子的數(shù)量，每只兔子1ml轉(zhuǎn)移到50ml離心管中放在冰上保持細(xì)胞活性，以備使用）。,兔自身免疫性干眼模型,實(shí)驗(yàn)方法 ：4、自身免疫干眼模型的制備釆用靜脈輸液器，預(yù)先將PBS充滿整個靜脈回輸裝置排空空氣預(yù)

22、防空氣栓塞。通過耳緣靜脈回輸激活的自體激活的外周血淋巴細(xì)胞（2x106/ml，1ml）為干眼模型組，耳緣靜脈碘伏消毒后用2ml的注射器推注1mLPBS確保液體進(jìn)入靜脈血管中，然后在接頭處換成有細(xì)胞液的注射器，注射前保證無細(xì)胞沉淀以防栓塞，勻速推注，最后換成裝有PBS的注射器，再輸入1ml左右的PBS保證細(xì)胞完全進(jìn)入到血管中，以防細(xì)胞丟失。靜脈回輸?shù)攘縋BS的新西蘭白兔為對照組。,兔自身免疫性干眼模型,臨床指標(biāo)的檢測 ：移植前和移植后2

23、周、4 周、6 周分別進(jìn)行以下臨床指標(biāo)的觀察：淚液分泌量實(shí)驗(yàn)（Schirmer’sⅠ實(shí)驗(yàn)）將兔子固定好，在非表麻條件下，將 Schirmer’s 試紙條頂端放置于下穹窿結(jié)膜中外側(cè)1/3處，檢查者輔助閉合兔眼，此時盡量避免兔子第三眼瞼遮住角膜以及試紙條，計時1分鐘后取出試紙條，記錄濕潤長度，試驗(yàn)過程中盡量避免試紙條接觸角膜，以免造成角膜上皮損傷。淚膜穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)（淚膜破裂時間tear break-up time，BUT）將兔子固定好

24、，眼表滴10μL熒光素液，檢查者輔助兔眨眼 3 次，計時1分鐘，檢查者輔助打開上下眼瞼，檢查者用手持裂隙燈，在鈷藍(lán)光下觀察角膜表面淚膜破裂時間以及淚河高度，重復(fù)三次取平均值。角膜、結(jié)膜熒光素鈉染色實(shí)驗(yàn)將兔子固定好，復(fù)方托比卡按散瞳，等待大約十分鐘，等其瞳孔完全散開后，眼表滴10μL熒光素液，計時1分鐘，使熒光素液均勻平鋪于眼表，檢查者輔助打開上下眼瞼，將裂隙燈下調(diào)至鈷藍(lán)光，觀察角膜、結(jié)膜的著染情況并拍照記錄。,兔自身免疫性干眼模型,

25、組織病理學(xué)觀察 ：分別于移植后6周從各組中新西蘭大白兔注射戊巴比妥鈉（56mg/kg）處死兔子，分離上下淚腺、結(jié)膜、角膜置于10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，HE染色后觀察浸潤細(xì)胞的情況。（1）取淚腺、結(jié)膜等組織塊，用 10%甲醛溶液固定，固定后常規(guī)石蠟包埋，切片。（2）石蠟包埋切片后用二甲苯脫蠟，二甲苯I、二甲苯Ⅱ各5min，100％乙醇、2min，95％的乙醇、1min，80％乙醇、75％的乙醇各1min，蒸餾水洗2min。

26、（3）蘇木素染色5min后沖洗。（4）1%鹽酸乙醇浸泡30s（數(shù)下）。（5）自來水浸泡15min。（6）伊紅液染色2min。（7）常規(guī)脫水， 95％乙醇I、1min，95％乙醇Ⅱ、1min，100％乙醇I、1min，100％乙醇Ⅱ、1min，二甲苯石碳酸（3：1）1min，二甲苯透明，二甲苯I、1min，二甲苯Ⅱ、1min。（8）中性樹脂封片固定。,兔自身免疫性干眼模型,淚腺組織RNA的提取 ：（1）分別于移植后6周將各組

27、中新西蘭大白兔注射戊巴比妥鈉（56mg/kg）處死兔子，收集上、下淚腺、結(jié)膜、角膜組織，將淚腺組織剪至1cm的組織塊裝于1.5mlEP管中，迅速放于液氮后轉(zhuǎn)移到-80℃的冰箱中。（2）將所提RNA組織找到放到液氮瓶中，現(xiàn)將研缽和研棒提前一天84液浸泡，提前2小時18.2純水浸泡，用衛(wèi)生紙擦干后先用液氮降溫，待研缽中的液氮穩(wěn)定后，將組織塊在液氮中研磨，保證充足的液氮，將組織塊研磨成粉末后，加入1ml的Trizol后轉(zhuǎn)移到1.5ml的EP

28、管中，充分吹打。（3）再按每1mlTrizol加入0.2ml比例的氯仿，蓋緊蓋子，用力上下劇烈搖晃15秒，呈粉色混合物。（4）常溫靜置15min，4℃離心機(jī)12000rpm 離心15min，離心后可見EP管內(nèi)分為三層，最上層為上清液，中間一層為白色膜狀物，最底層為紅色沉淀物。（5）將上清轉(zhuǎn)移至另一新的標(biāo)記好的1.5mL進(jìn)口EP管中，再加入等體積的異丙醇，室溫靜置10min，4℃ 離心機(jī)12000rpm離心10min。,兔自身免疫性

29、干眼模型,淚腺組織RNA的提取 ：（6）棄掉上清，加入1ml的75%乙醇（提前配置：750uL無水乙醇+250uL DEPC水），倒置上下?lián)u晃幾次，4℃ 離心機(jī)10000rpm 離心5min。（7）觀察管底，避免槍頭碰到管底，棄掉上清，打開管蓋干燥10min。（8）隨后將RNA溶于20uL的DEPC水中，置于冰上，混勻后取1μL在NanoDrop ND-100上測RNA濃度，測三次，取其均值，記錄標(biāo)注好并將RNA-保存在80℃冰箱

30、中。,兔自身免疫性干眼模型,淚腺組織RNA逆轉(zhuǎn)錄 ：（1）將保存于-80℃的所需的RNA置于冰上待其溶解，根據(jù)標(biāo)注好所測的濃度按照1μgRNA，20μl體系逆轉(zhuǎn)錄，計算出不同RNA所加的體積。（2）先將RNA所在EP管渦旋離心，將標(biāo)記好的EP管分別加入計算好體積的RNA，Oligo(dT)1μl,DEPC水補(bǔ)到12μl，渦旋離心后置于冰上待用。（3）用Thermo PCR儀，提前設(shè)置好溫度時間，待PCR儀機(jī)器蓋子溫度升高后放入樣本

31、，65℃ 5min。（4）取出樣本置于冰上，每個樣本按順序加入 5×Reaction buffer 4μl Inhibitor 1μl Transcriptase 1μl 10MmdNTP Mix

32、 2μl（5）渦旋離心混勻后，待PCR儀機(jī)器蓋子溫度升高到40℃后放入各樣本，42℃ 60分鐘，70℃ 5分鐘，待反應(yīng)結(jié)束后即EP管中的為逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA，將其逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA置于冰上，然后用DEPC水稀釋10倍，渦旋離心混勻后置于-80℃冰箱保存。,兔自身免疫性干眼模型,實(shí)時定量PCR（quantitative real-time PCR）RT-PCR ：反應(yīng)原理:使用美國Applied Biosystems公司的實(shí)時

33、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀分析應(yīng)用 Applied Biosystems 7900HT FastReal-time PCR System，SYBR Green 法，使用 Fast SYBR@Green Master Mix。在PCR反應(yīng)過程中SYBRGreen熒光染料摻入DNA雙鏈后發(fā)射熒光信號，而不摻入DNA雙鏈的SYBR熒光染料不會有熒光信號，所以SYBR Green熒光信號與DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的增加一致。雙鏈DNA在變性過程中解

34、開呈單鏈，沒有熒光, 在形成雙鏈DNA的復(fù)性和延伸過程中, SYBR Green發(fā)出熒光，此階段PCR儀器釆集熒光信號。利用此信號的變化對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增量的變化進(jìn)行檢測，用循環(huán)數(shù)對基因定量分析。GAPDH將作為反應(yīng)內(nèi)在參照, 用內(nèi)參對所檢測樣品所含的DNA進(jìn)行定量分析的方法。相對定量結(jié)果分析采用比較熒光強(qiáng)度達(dá)閾值時的循環(huán)數(shù)(Ct)值法（2-ΔΔCt法），擴(kuò)增的倍數(shù)=2-ΔΔCt，ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參）實(shí)驗(yàn)組-

35、（Ct目的基因-Ct內(nèi)參）對照組。各指標(biāo)均重復(fù)檢測3次，取平均值。本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)時定量PCR檢測淚腺組織中Th1、Th17、Treg細(xì)胞分化相關(guān)細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子mRNA相對表達(dá)量。,兔自身免疫性干眼模型,實(shí)時定量PCR（quantitative real-time PCR）RT-PCR ：所測基因上下游引物序列如下：GAPDH Forward primer GGGTGGTGGACCTCATGGT

36、 Reverse primer CGGTGGTTTGAGGGCTCTTAIFN-γ Forward primer CTCTGCCTCATCTTGGGTTCTT Reverse primer GGTGTTCTGTTTCTCTGGTTAGTGTGTIL-10 Forward primer GGCTGAGGCTGCG

37、ACAAT Reverse primer TGCCTTGCTCTTGTTTTCACATGF-β Forward primer CAAGGACCTGGGCTGGAA Reverse primer AGGCAGAAGTTGGCGTGGTAIL-6 Forward primer GCA

38、GAAAAACCAGTGGCTGAA Reverse primer GGCCGCGCAGGATGAIL-17 Forward primer GGAATGAGGACCACCACATGA Reverse primer CTGCGTAGGACCAGGATCTCTTTNF-α Forward pri

39、mer AGCTTCTCGGGCCCTGAGT Reverse primer CCACTTGCGGGTTTGCTACTT-bet Forward primer GATGCGCCAGGAAGTTTCA Reverse primer TGTTGGAGGCCCCTTTATTGRORrt Forwa

40、rd primer GGCCTACCACGCCGA Reverse primer TCCATGCCACCGTATTTGC,兔自身免疫性干眼模型,實(shí)時定量PCR（quantitative real-time PCR）RT-PCR ：（1）從-20℃冰箱中取出引物，置于冰上待其完全溶解，先配置100uM濃度的，混合均勻，隨后分裝稀釋到4uM濃度的引物。（2）從-20℃冰箱中取出Fa

41、stSYBR Green Master Mix，置于冰上避光待其完全溶解待用。（3）從-80 ℃冰箱中取出cDNA置于冰上待其完全溶解，溶解后混均勻。（4）8ul反應(yīng)體系包括: SYBR Green 4ul 上游引物（4uM） lul 下游引物（4uM） lul

42、 cDNA 2ul提前配置好SYBR Green和上下游引物的混合液，計算好所需的cDNA的量，384孔板中每孔先加入SYBR Green和上下游引物的混合液，再根據(jù)樣本所檢測加入cDNA。,兔自身免疫性干眼模型,實(shí)時定量PCR（quantitative real-time PCR）RT-PCR ：（5）配制混合液和384孔板的上樣操作過程均需避光進(jìn)行，加樣結(jié)束后，38

43、4孔板封膜。（6）先將384孔板置于禍旋器渦旋lO秒，使其反應(yīng)體系充分混合均勻。（7）提前預(yù)冷離心機(jī)，再將384孔板置于離心機(jī)4000rpm ，4min離心。（8）再將384孔板放入Applied Biosystems 7900HT Fast Rea1-Time PCR 儀,做好標(biāo)記,設(shè)好參數(shù)開始，50℃ 2min,95℃ 10min, 40個循環(huán)，循環(huán)條件為95°C,15s,60℃ 1min。（9）結(jié)束后保存數(shù)據(jù)，分

44、析結(jié)果。,兔自身免疫性干眼模型,流式細(xì)胞檢測 Treg 細(xì)胞 ：淚腺組織流式細(xì)胞學(xué)檢測（1）新西蘭大白兔用陸眠寧和氯胺酮麻醉后，空氣栓塞處死兔子，新西蘭大白兔處死后，在超凈臺中摘取右下下淚腺，轉(zhuǎn)移到含有雙抗的 Ham's 液的 50ml離心管中。（2）在細(xì)胞間超凈臺進(jìn)行以下操作，將淚腺和少量的Ham’s液放入培養(yǎng)皿中，先剔除淚腺組織周圍的血管、脂肪組織和筋膜，無菌刀將腺體切碎至約1mm×1mm的組織塊，用移液槍加

45、入Hank’s液后吹打吹散組織塊，在50ml離心管中傾斜靜置15min，棄掉上清。（3）然后再加入Ham’s液吹打均勻傾斜靜置15min，小心棄掉上清，以防組織塊的丟失。（4）提前配制好膠原酶消化液，將濃度為 600U/ml 的膠原酶加入到淚腺組織塊中,其置于 37℃水浴箱，（5）離心管置于水浴箱中，約 20min 搖晃離心管數(shù)二三十次，使組織塊充分接觸消化酶，觀察組織塊的大小，消化 3h 左右。（6）將組織塊消化的混合液加 H

46、am's 液稀釋，用 40um 的細(xì)胞濾過篩過濾，過濾掉其余雜質(zhì)。,兔自身免疫性干眼模型,流式細(xì)胞檢測 Treg 細(xì)胞 ：淚腺組織流式細(xì)胞學(xué)檢測（7）將細(xì)胞消化液離心 2000rpm, 6min，離心后棄上清，用 PBS 緩沖液重懸后再次離心，2000rpm, 6min，隨后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。（8）同樣在觀察細(xì)胞形態(tài)和純度的同時進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞的密度，取各組數(shù)量相等的細(xì)胞于流式管中,離心 2000rpm,

47、6min。（9）棄掉上清，每管加入 600ul 固定液，吹打均勻， 4°C 冰箱避光保存過夜，細(xì)胞固定打孔。（10）次日各流式管中加入 600ul 緩沖液,離心 1500rpm,lOmin，棄上清，重復(fù)再洗一遍。（11）棄上清, 每孔加入 50ul 緩沖液, FITC-anti Rabbit-CD4, PE-antihmnan-F0XP3各加入 1ul 進(jìn)行染色，渦旋后，避光放入 4°C 冰箱。（13）棄上清

48、加入 600ul 緩沖液，離心 1500rpm,lOmin，棄上清加入緩沖液1500rpm,lOmin 再次離心后。（14）棄掉上清，用 lOOul 緩沖液重懸，渦旋后上美國 BD 公司 FACS 流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。,兔自身免疫性干眼模型,流式細(xì)胞檢測 Treg 細(xì)胞 ：脾臟組織流式細(xì)胞學(xué)檢測（1）陸眠寧和氯胺酮將兔子麻醉后，空氣栓塞處死兔子。腹部備皮,并用清潔消毒鋪巾。在超凈臺中用手術(shù)刀打開腹腔，找到胃，并向后翻，找到脾臟組織

49、并分離，先置于有雙抗的 RPMI-1640 培養(yǎng)基的 50ml 離心管中。（2）進(jìn)入細(xì)胞超凈臺，提前準(zhǔn)備好 lOOmm 細(xì)胞培養(yǎng)皿，將取出的脾臟和少量的 RPMI-1640 培養(yǎng)基一起放入培養(yǎng)皿中,用 400 目的濾網(wǎng)碾磨。研磨完全。（3）先用培養(yǎng)基將固定好的棉花柱(20ml)浸潤濕，將吹打均勻的組織懸液過棉花柱，過濾到棉花柱正下方的 50ml 離心管中,離心,2000rpm,8min。（4）棄上清，用 20ml 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,

50、吹打均勻后緩緩將細(xì)胞懸液加入到等體積的 20ml Ficoll 液面上,離心 2000rpm, 20min，上下加速度為 0。（5）離心后離心管中分三層，同分離外周血淋巴細(xì)胞，吸取中間層白色霧狀的淋巴細(xì)胞，離心 2000rpm,8min，棄上清再洗一遍。（6）倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和純度的同時進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞的密度，取各組數(shù)量相等的細(xì)胞于流式管中,離心 2000rpm, 6min。,兔自身免疫性干眼模型,流式細(xì)胞檢測 Tre

51、g 細(xì)胞 ：脾臟組織流式細(xì)胞學(xué)檢測（7）棄掉上清，每管加入 600ul 固定液，吹打均勻， 4°C 冰箱避光保存過夜，細(xì)胞固定打孔。（8）次日各流式管中加入 600ul 緩沖液,離心 1500rpm，10min，棄上清，重復(fù)再洗一遍。（9）棄上清, 每孔加入 50ul 緩沖液, FITC-anti Rabbit-CD4, PE-antihmnan-F0XP3各加入 1ul 進(jìn)行染色，渦旋后，避光放入 4°C