尿路缺損肌性管腔修復(fù)的種子細(xì)胞實驗研究.pdf

1、第一部分：Beagle犬脂肪干細(xì)胞原代培養(yǎng)及誘導(dǎo)成肌細(xì)胞的實驗研究
　　 目的：驗證犬脂肪干細(xì)胞(ADSCs)原代培養(yǎng)及誘導(dǎo)成肌細(xì)胞方法的可行性，并為肌性管腔的構(gòu)建提供可靠的種子細(xì)胞。
　　 方法：取雄性Beagle犬腹股溝處皮下脂肪組織，使用酶消化法行原代脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)，并對所培養(yǎng)的ADSCs表面標(biāo)志進(jìn)行流式細(xì)胞儀鑒定；取第1代培養(yǎng)至對數(shù)生長期細(xì)胞分為實驗組A和對照組B兩組，誘導(dǎo)劑為10μmol/L的5-aza，每日倒

2、置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并在誘導(dǎo)的第7，14，21，28天行細(xì)胞免疫熒光和流式細(xì)胞儀檢測其特異性成肌細(xì)胞特異性抗原desmin和myosin的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：成功從犬腹股溝部皮下脂肪組織分離、培養(yǎng)出ADSCs，相關(guān)表面抗原表達(dá)檢測證實其干細(xì)胞特性。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化顯示：誘導(dǎo)組細(xì)胞誘導(dǎo)3周出現(xiàn)成肌細(xì)胞特有的“漩渦”樣生長形態(tài)，在誘導(dǎo)的第4周單個細(xì)胞表現(xiàn)出多核化；免疫熒光和流式細(xì)胞儀檢測顯示：desmin和m

3、yosin的表達(dá)率在誘導(dǎo)28天時達(dá)最高，分別為59.4％和56.1％，而誘導(dǎo)前和對照組細(xì)胞均呈陰性表達(dá)。
　　 結(jié)論：本實驗進(jìn)一步證明了脂肪干細(xì)胞可通過誘導(dǎo)向成肌細(xì)胞方向分化，為下一步實驗提供了可靠的種子細(xì)胞。
　　 第二部分：Beagle犬上支細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定的實驗研究
　　 目的：探討犬上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法的可行性，并為尿路肌性管腔粘膜上皮提供可靠的種子細(xì)胞。
　　 方法：取雄性Beagle犬口腔

4、黏膜上皮組織，使用酶消化法行上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)，使用3T3細(xì)胞作為細(xì)胞飼養(yǎng)層，細(xì)胞生長至培養(yǎng)皿80％左右行傳代處理；每日倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化；取第一代生長至對數(shù)期細(xì)胞行細(xì)胞免疫熒光和流式細(xì)胞儀鑒定表皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白AE1/AE3的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：上皮細(xì)胞生長較緩慢，原代需培養(yǎng)20天方能達(dá)到100mm培養(yǎng)皿的80％左右，傳代后生長速度明顯加快，一般10天就能達(dá)到100mm培養(yǎng)皿的80％；細(xì)胞鑒定采用國際上上皮類組織比較