SPIO與Fth1基因標記MSCs體外分化為心肌細胞的MRI研究.pdf

1、目的：本研究旨在評價鐵蛋白基因Fth1標記大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）的可行性、有效性及安全性。觀察不同濃度的超順磁性氧化鐵（SPIO）及Fth1基因標記對MSCs增殖活性的影響。探討SPIO及Fth1基因標記兩種方法對MSCs定向分化心肌細胞分化能力的影響。體外研究SPIO及Fth1基因標記MSCs定向分化心肌細胞的MRI表現(xiàn)及其差異。
　　方法：
　　1.采用全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)SD大鼠MSCs，流式細胞儀檢測細胞

2、表面抗原CD34、CD44及CD90，成骨及成脂肪誘導分化進行鑒定。
　　2.構建攜帶鐵蛋白重鏈基因Fth1的慢病毒表達載體。Fth1報告基因慢病毒轉(zhuǎn)染MSCs熒光顯微鏡觀察增強型綠色熒光蛋白EGFP表達，qRT-PCR、Western blot檢測Fth1基因及目的蛋白表達情況。
　　3.將不同濃度（25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml）的超順磁性氧化鐵（SPIO）標記MSCs；普魯士藍染色檢測

3、SPIO標記效率； CCK-8法檢測SPIO標記MSCs的增殖活性。
　　4.用不同濃度檸檬酸鐵培養(yǎng)液（0.1 mol/L、1 mol/L、3 mol/L、5 mol/L、7 mol/L）培養(yǎng)Fth1-MSCs，普魯士藍染色檢測細胞攝鐵情況，CCK-8法檢測Fth1-MSCs的增殖活性。
　　5.將50μg/ml SPIO和Fth1標記的MSCs體外經(jīng)10μmol/L5-aza誘導向心肌細胞分化，誘導28天后病理染色檢測心肌

4、特異性標記物（α-肌動蛋白、心肌肌鈣蛋白T）的表達情況。在標記后不同時間點，對兩組MSCs定向分化的心肌細胞進行MRI檢查，觀察其信號變化情況及兩組信號的差異性。
　　結果：
　　1.全骨髓貼壁法提取的MSCs呈梭形、放射狀排列并貼壁生長，CD34、CD44及CD90陽性細胞率分別為2.8％，99.8%，99.5%，具有向骨細胞及脂肪細胞定向分化的能力。
　　2.通過酶切PCR鑒定及重組載體基因測序驗證，成功構建攜帶鐵

5、蛋白重鏈Fth1及熒光蛋白基因的過表達慢病毒載體pCDH-EGFP-Fth1。
　　3. Fth1基因成功轉(zhuǎn)染MSCs，熒光顯微鏡下觀察約80%MSCs表達EGFP，qRT-PCR及Western blot檢測鐵蛋白重鏈基因及其目的蛋白表達量較普通MSCs明顯增加。
　　4.與濃度25μg/ml、75μg/ml及100μg/ml的比較，濃度50μg/ml的SPIO對 MSCs標記效率高，可達98%，且對MSCs增殖活性影響較

6、小，與濃度25μg/ml組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），而濃度為75μg/ml及100μg/ml的SPIO雖然標記效率高，但對MSCs增殖活性有明顯影響，與對照組、25μg/ml組及50μg/ml組比較差異有明顯統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　5.未加入檸檬酸鐵培養(yǎng)液培養(yǎng)，F(xiàn)th1-MSCs增殖活性與對照組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；加入Fe濃度為0.1 mol/L的含鐵培養(yǎng)液后，普魯士藍染色未觀察到藍色顆粒；加入

7、Fe濃度為1 mol/L、3 mol/L、5 mol/L、7 mol/L條件培養(yǎng)基的Fth1-MSCs細胞質(zhì)內(nèi)均有藍色顆粒，并隨條件培養(yǎng)基鐵濃度增加而染色加深，但隨著濃度的增加，細胞的形態(tài)受到一定影響，且細胞增殖活性與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　6.50μg/ml SPIO及Fth1標記MSCs定向誘導分化后均能表達心肌細胞特異性標記物（α-肌動蛋白、心肌肌鈣蛋白T）。隨著SPIO濃度升高，MRI的T2信號

8、逐漸降低；SPIO標記MSCs心肌細胞分化過程中隨時間延長信號逐漸降低，至28天時MRI T2信號無降低，與標記前相同。Fth1-MSCs加入檸檬酸鐵培養(yǎng)液5天后MRI上T2信號降低，且隨時間延長信號無明顯變化，28天時MRI T2信號與5天、14天相比差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　結論：
　　1.可成功構建攜帶Fth1的慢病毒過表達載體，轉(zhuǎn)染后的Fth1-MSCs能穩(wěn)定、高效地表達Fth1，并不影響其增殖活性，

9、但加入檸檬酸鐵培養(yǎng)基后對細胞增殖有一定影響。
　　2.50μg/ml濃度的SPIO可高效標記MSCs，MRI信號改變明顯，且對細胞增殖活性影響相對較小，為標記MSCs的最適SPIO濃度。
　　3. Fth1的慢病毒過表達載體轉(zhuǎn)染MSCs在未加入檸檬酸鐵培養(yǎng)液培養(yǎng)時，對Fth1-MSCs增殖活性沒有影響，條件培養(yǎng)基鐵濃度越高，細胞攝入鐵也越多，但對細胞形態(tài)及增殖活性影響越大，因此選擇1 mol/L的檸檬酸鐵培養(yǎng)液較為適宜。