Id3在慢性病毒感染中對CD8+T細(xì)胞表型及功能的調(diào)控.pdf

1、慢性病毒感染，如HIV，HBV，HCV感染等嚴(yán)重威脅著人類健康，其中尤以HIV病毒感染是目前醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的難題和熱點。目前臨床針對HIV主要采取HAART療法，但是HAART治療無法完全清除人體內(nèi)所有潛伏的HIV病毒。HIV病毒在感染后早期即可侵入淋巴濾泡內(nèi)的TFH細(xì)胞并潛伏起來從而逃過HAART藥物治療和免疫細(xì)胞的殺傷，這些被感染的TFH細(xì)胞成為徹底治愈HIV患者的最大障礙。因此除外源性藥物治療外，有必要更加深入的了解慢性病毒感染情況

2、下的免疫影響機(jī)制，為增強機(jī)體免疫系統(tǒng)清除病毒和免疫監(jiān)視能力從而進(jìn)一步控制感染提供新的治療策略。
　　在免疫系統(tǒng)中，CD8+T細(xì)胞通過殺傷被病毒感染的靶細(xì)胞而成為控制病毒感染的主要細(xì)胞亞群。在急性病毒感染過程中，CD8+T細(xì)胞被激活后開始大量增殖，并且在短期內(nèi)迅速清除體內(nèi)的病毒。隨之在失去抗原刺激后大部分CD8+T細(xì)胞走向凋亡，但是其中仍有少量細(xì)胞繼續(xù)生存下來并分化為病毒特異性的記憶性CD8+T細(xì)胞。這些記憶性CD8+T細(xì)胞能夠?qū)ο?/p>

3、同抗原再次快速產(chǎn)生效應(yīng)，同時具有很強的增殖潛力并且可以在沒有抗原的情況下長期維持穩(wěn)態(tài)增殖，從而為機(jī)體提供長久的保護(hù)。相反，在慢性病毒感染中，CD8+T細(xì)胞無法完全清除病毒，并長期接受病毒抗原的刺激以及其它抑制性信號的調(diào)節(jié)，從而隨著病毒感染的進(jìn)程而逐漸喪失自身的功能，最終走向耗竭(exhaustion)。
　　慢性病毒感染中的CD8+T細(xì)胞表面開始逐漸表達(dá)多種抑制性受體并且隨著耗竭程度的加深其表達(dá)的數(shù)量和種類也逐漸提高。同時，耗竭的

4、CD8+T細(xì)胞逐步喪失自身的多種抗病毒功能，而最后嚴(yán)重耗竭的病毒特異性CD8+T細(xì)胞自身開始凋亡，數(shù)量逐漸減少。在慢性病毒感染過程中，更高的病毒載量、更持久的感染過程或者更少來自CD4+T細(xì)胞的幫助都會造成更嚴(yán)重的CD8+T細(xì)胞耗竭。而在人類的慢性病毒感染，如HIV，HBV，HCV和HTLV等感染中，同樣發(fā)現(xiàn)了CD8+T細(xì)胞的耗竭和凋亡。
　　然而在慢性病毒感染過程中，耗竭的CD8+T細(xì)胞仍然具有部分效應(yīng)功能，并且在一定程度上控制

5、病毒的復(fù)制。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在LCMV-Cl13小鼠感染模型的耗竭CD8+T細(xì)胞中存在一群CXCR5陽性的CD8+T細(xì)胞。這群細(xì)胞相較于其它CXCR5陰性的CD8+T細(xì)胞，其表面表達(dá)更少的起負(fù)調(diào)控作用的抑制性分子如PD-1、Tim3、2B4、Lag3等。在接受體外刺激后，CXCR5+ CD8+T細(xì)胞能夠分泌更多的細(xì)胞因子和脫顆粒標(biāo)志物CD107，而且有更多比例的細(xì)胞能同時分泌多種細(xì)胞因子。同時，這群細(xì)胞也表現(xiàn)出更強的細(xì)胞殺傷和控制病毒復(fù)

6、制的能力，較高地表達(dá)與記憶細(xì)胞相關(guān)的表面分子CD127和CD62L，具有更強的增殖能力和類似造血干細(xì)胞一樣的能力。因此，這群CXCR5+ CD8+T細(xì)胞可能在耗竭的T細(xì)胞中起主要的抗病毒的作用。而最近在包括LCMV、SIV、HIV等慢性病毒感染的多項研究中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)CXCR5的病毒特異性的CD8+T細(xì)胞遷移進(jìn)入淋巴組織B細(xì)胞濾泡的現(xiàn)象。并且這群CXCR5+ CD8+T細(xì)胞能夠殺傷濾泡中被感染的TFH細(xì)胞，控制TFH細(xì)胞內(nèi)的病毒復(fù)制，這一

7、群細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為削減HIV病毒以及功能性治愈HIV感染提供了新的重要線索。
　　在急性和慢性病毒感染中，CD8+T細(xì)胞的分化或功能受到一系列分子通路和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，其中DNA結(jié)合抑制蛋白(ID蛋白)是急性病毒感染中調(diào)控CD8+T細(xì)胞分化的重要分子。在急性病毒感染中，Id3能夠促進(jìn)記憶性CD8+T細(xì)胞形成并通過增強調(diào)節(jié)DNA復(fù)制和修復(fù)相關(guān)的基因表達(dá)來維持其存活。此外Id2也參與調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞的分化，并且與Id3的作用截然相反。而

8、且Id2可能通過E2A來抑制性調(diào)節(jié)Id3的表達(dá)。而在LCMV慢性病毒感染中，E2A能夠直接與Cxcr5基因的調(diào)控區(qū)結(jié)合并促進(jìn)CD8+T細(xì)胞表面CXCR5的表達(dá)，Id2則可以抑制E2A與該基因的結(jié)合。敲除Id2或者過表達(dá)E2A均能夠促進(jìn)CXCR5陽性CD8+T細(xì)胞的生成，并增強CXCR5+ CD8+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力和細(xì)胞殺傷能力。在LCMV-Docile慢性感染模型中，Id3+2B4-的病毒特異性CD8+T細(xì)胞也能夠分化為Id3-

9、2B4-或者Id3-2B4+的病毒特異性CD8+T細(xì)胞，而不能反向分化。而過表達(dá)Id3則能夠抑制CD8+T細(xì)胞表面Fas的表達(dá)，減少來自Fas/FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來維持CD8+T細(xì)胞的存活。因此急性病毒感染后Id3高表達(dá)的CD8+T細(xì)胞和慢性病毒感染中CXCR5+ CD8+T細(xì)胞在表型、功能和分化等多個方面均表現(xiàn)出高度的一致性。但是慢性病毒感染情況下CD8+T細(xì)胞內(nèi)Id3與CXCR5表達(dá)之間的關(guān)系以及Id3對CXCR5+CD8+T細(xì)

10、胞表型和功能的影響仍不清楚。
　　因此，我們對Id3在慢性病毒感染中對CXCR5陽性CD8+T細(xì)胞的表型和功能的調(diào)控作用進(jìn)一步研究，本研究中的實驗方法、實驗結(jié)果和結(jié)論條列如下:
　　1.我們在普通B6小鼠感染LCMV-Cl13病毒后的第8，24和32天，取小鼠的脾細(xì)胞，經(jīng)CD8+T細(xì)胞富集后通過抗體染色和流式細(xì)胞分選分別獲得CXCR5+ CD8+T細(xì)胞和CXCR5-CD8+T細(xì)胞，抽取二者的總RNA并將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再

11、通過RT-qPCR測量兩群細(xì)胞中Id2和Id3的mRNA表達(dá)量。結(jié)果顯示相較于CD44hi CXCR5-CD8+T細(xì)胞，CD44hi CXCR5+ CD8+T細(xì)胞中的Id3表達(dá)量在LCMV慢性感染后的三個時間點均較高，而Id2表達(dá)量較低。并且Id2和Id3在這兩群細(xì)胞中的表達(dá)量在這段時間內(nèi)保持穩(wěn)定。
　　2.給予CD4Cre Id2flox/flox小鼠LCMV-Cl13病毒感染，并在耗竭期取脾臟細(xì)胞計數(shù)并行流式染色分析CD44h

12、i CXCR5+和CD44hi CXCR5-CD8+T細(xì)胞的數(shù)量、表面抑制性分子的表達(dá)和分泌細(xì)胞因子的功能。結(jié)果表明，Id2-/-小鼠脾臟中CD44hi CXCR5+ CD8+T細(xì)胞占已被激活的CD8+T細(xì)胞的比例和數(shù)量均升高，而表面抑制性分子的表達(dá)量下降。經(jīng)體外病毒肽刺激后，Id2條件敲除小鼠體內(nèi)能夠分泌細(xì)胞因子TNFα或表達(dá)脫顆粒標(biāo)志物CD107a/b的CD8+T細(xì)胞數(shù)更多。同時Id2敲除小鼠較普通小鼠脾臟和肺臟中病毒滴度顯著降低。

13、
　　3.給予CD4Cre Id3flox撇小鼠LCMV-Cl13病毒感染，在耗竭期取脾臟細(xì)胞計數(shù)并行流式染色分析CD44hi CXCR5+和CD44hi CXCR5-CD8+T細(xì)胞的數(shù)量和功能。結(jié)果表明，兩組小鼠中CD44hi CXCR5+ CD8+T細(xì)胞表面抑制性分子的表達(dá)量均較CXCR5-CD8+T細(xì)胞群為低。但是Id3條件敲除小鼠脾臟中CD44hi CXCR5+ CD8+T細(xì)胞占已被激活的CD8+T細(xì)胞的比例沒有出現(xiàn)改變，

14、而CD44hi CXCR5+和CD44hi CXCR5-CD8+T細(xì)胞的數(shù)量均增加，兩群細(xì)胞表面抑制性分子的表達(dá)量均下降。經(jīng)體外病毒肽刺激后，Id3條件敲除小鼠體內(nèi)CD8+T細(xì)胞能夠分泌更多的細(xì)胞因子TNFα并表達(dá)更多的脫顆粒標(biāo)志物CD107a/b。同時通過RT-qPCR方法測量兩組小鼠的組織內(nèi)所含病毒滴度顯示Id3敲除小鼠較普通小鼠脾臟和肺臟中病毒滴度顯著降低近10倍。
　　4.我們構(gòu)建了Id3過表達(dá)質(zhì)粒，并最終將其轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入P1

15、4細(xì)胞。然后將這些細(xì)胞注入受體小鼠體內(nèi)并給予LCMV-Cl13感染。在感染后第8天我們測量了過表達(dá)Id3的P14細(xì)胞中CXCR5的表達(dá)以及分泌細(xì)胞因子的能力。結(jié)果顯示，過表達(dá)Id3和對照組的P14細(xì)胞中CXCR5的表達(dá)量無顯著差異，而Id3過表達(dá)也未顯著改變整體CD8+T細(xì)胞的功能。
　　5.通過HIV患者淋巴結(jié)免疫熒光染色我們發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞遷移進(jìn)入B細(xì)胞淋巴濾泡。淋巴結(jié)細(xì)胞流式染色發(fā)現(xiàn)，CXCR5+CD8+T細(xì)胞表達(dá)較高的I